Мононуклеарните клетки на периферната крв (PBMCs) често се обработуваат за да се одделат од целата крв со центрифугирање на градиент на густина.Тие клетки се состојат од лимфоцити (Т-клетки, Б-клетки, NK-клетки) и моноцити, кои најчесто се користат во областа на имунологијата, клеточната терапија, заразни болести и развој на вакцини.Следењето и анализата на одржливоста и концентрацијата на PBMC е од клучно значење за клиничките лаборатории, основните медицински истражувања на науки и производството на имуните клетки.
Сл. 1. Изолиран PBMC од свежа крв со центрифугирање со градиент на густина
Броење со двојно флуоресцес AOPI е тип на анализа што се користи за откривање на клеточната концентрација и одржливост.Растворот е комбинација од акридин портокал (боја зелено-флуоресцентна нуклеинска киселина) и пропидиум јодид (црвено-флуоресцентна нуклеинска киселина дамка).Пропидиум јодид (PI) е боја за исклучување на мембраната која навлегува само во клетките со компромитирани мембрани, додека акридин портокалот може да навлезе во сите клетки во популацијата.Кога двете бои се присутни во јадрото, пропидиум јодид предизвикува намалување на флуоресценцијата на акридин портокаловата флуоресценција со пренос на енергија со флуоресцентна резонанца (FRET).Како резултат на тоа, нуклеарните клетки со недопрени мембрани обојуваат флуоресцентно зелено и се бројат како живи, додека нуклеарните клетки со компромитирани мембрани обојуваат само флуоресцентно црвено и се бројат како мртви кога се користи системот Countstar® FL.Материјалот без јадра како што се црвените крвни зрнца, тромбоцитите и остатоците не флуоресираат и се игнорираат од софтверот Countstar® FL.
Експериментална постапка:
1. Разредете го примерокот PBMC во 5 различни концентрации со PBS;
2. Додадете 12µl AO/PI раствор во 12µl примерок, нежно измешан со пипета;
3. Нацртајте 20 µl смеса во таблата од комората;
4. Оставете ги клетките да се сместат во комората околу 1 минута;
5. Инсектирајте го лизгачот во инструментот Countstar FL;
6.Изберете ја анализата „AO/PI Viability“, а потоа тестирајте од Countstar FL.
Внимание: AO и PI е потенцијален канцероген.Се препорачува операторот да носи лична заштитна опрема (ППЕ) за да избегне директен контакт со кожата и очите.
Резултат:
1. Светло поле и флуоресцентни слики на PBMC
Бојата AO и PI се обете дамки на ДНК во клеточното јадро на клетките.Затоа, тромбоцитите, црвените крвни зрнца или клеточниот отпад не можат да влијаат на концентрацијата и одржливоста на PBMCs.Живите клетки, мртвите клетки и остатоците може лесно да се разликуваат врз основа на сликите генерирани од Countstar FL (Слика 1).
Слика 2. Светло поле и флуоресцентни слики на PBMC
2. Концентрација и одржливост на PBMC
Примероците PBMC беа разредени во 2, 4, 8 и 16 пати со PBS, потоа тие примероци беа инкубирани со мешавина на бои AO/PI и анализирани со Countstar FL соодветно.Резултатот од концентрацијата и одржливоста на PBMC е прикажан на следнава слика:
