Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) se často zpracovávají k oddělení od plné krve centrifugací v hustotním gradientu.Tyto buňky se skládají z lymfocytů (T buňky, B buňky, NK buňky) a monocytů, běžně používaných v oblasti imunologie, buněčné terapie, infekčních onemocnění a vývoje vakcín.Monitorování a analýza životaschopnosti a koncentrace PBMC je zásadní pro klinické laboratoře, základní lékařský vědecký výzkum a produkci imunitních buněk.
Obr. 1. Izolované PBMC z čerstvé krve centrifugací s hustotním gradientem
AOPI Dual-fluoresces counting je typ testu používaný pro detekci buněčné koncentrace a životaschopnosti.Roztok je kombinací akridinové oranže (zeleně fluorescenční barvivo nukleové kyseliny) a propidiumjodidu (červeně fluorescenční barvivo nukleové kyseliny).Propidium jodid (PI) je membránové vylučovací barvivo, které proniká pouze do buněk s narušenými membránami, zatímco akridinová oranž je schopna proniknout do všech buněk v populaci.Pokud jsou v jádře přítomna obě barviva, propidium jodid způsobí snížení fluorescence akridinové oranže přenosem fluorescenční rezonanční energie (FRET).V důsledku toho se buňky s jádry s neporušenými membránami barví fluorescenčně zeleně a jsou počítány jako živé, zatímco buňky s jádry s narušenými membránami se barví pouze fluorescenčně červeně a jsou počítány jako mrtvé při použití systému Countstar® FL.Materiál bez jádra, jako jsou červené krvinky, krevní destičky a zbytky, nefluoreskují a software Countstar® FL je ignoruje.
Experimentální procedura:
1.Zřeďte vzorek PBMC na 5 různých koncentrací pomocí PBS;
2. Přidejte 12 µl roztoku AO/PI do 12 µl vzorku, jemně promíchejte pipetou;
3.Natáhněte 20 ul směsi do komorového sklíčka;
4.Nechte buňky usadit v komoře asi 1 minutu;
5. Nasaďte sklíčko do přístroje Countstar FL;
6. Vyberte test „AO/PI Viability“ a poté otestujte pomocí Countstar FL.
Upozornění: AO a PI je potenciální karcinogen.Doporučuje se, aby obsluha nosila osobní ochranné prostředky (OOP), aby se zabránilo přímému kontaktu s kůží a očima.
Výsledek:
1. Jasné pole a fluorescenční snímky PBMC
AO a PI barvivo jsou obě skvrny DNA v buněčném jádře buněk.Proto krevní destičky, červené krvinky nebo buněčné zbytky nejsou schopny ovlivnit koncentraci a výsledek životaschopnosti PBMC.Živé buňky, mrtvé buňky a zbytky lze snadno rozlišit na základě snímků generovaných Countstar FL (obrázek 1).
Obrázek 2．Snímky světlého pole a fluorescence PBMC
2.Koncentrace a životaschopnost PBMC
Vzorky PBMC byly zředěny 2, 4, 8 a 16krát PBS, poté byly tyto vzorky inkubovány se směsí barviv AO/PI a analyzovány pomocí Countstar FL, v daném pořadí.Výsledek koncentrace a životaschopnosti PBMC je znázorněn na následujícím obrázku:
