Iċ-ċelloli mononukleari tad-demm periferali (PBMCs) spiss jiġu pproċessati biex jiġu separati mid-demm sħiħ permezz ta 'ċentrifugazzjoni tal-gradjent tad-densità.Dawk iċ-ċelloli huma jikkonsistu minn limfoċiti (ċelluli T, ċelluli B, ċelluli NK) u monoċiti, komunement użati fil-qasam tal-immunoloġija, terapija taċ-ċelluli, mard infettiv u żvilupp ta 'vaċċini.Il-monitoraġġ u l-analiżi tal-vijabbiltà u l-konċentrazzjoni tal-PBMC huma kruċjali għal-laboratorji kliniċi, ir-riċerka bażika fix-xjenza medika u l-produzzjoni taċ-ċelluli immuni.
Fig 1. PBMC iżolat minn demm frisk b'ċentrifugazzjoni gradjent Density
L-għadd AOPI Dual-fluoresces huwa t-tip ta' assaġġ użat għall-iskoperta tal-konċentrazzjoni taċ-ċelluli u l-vijabbiltà.Is-soluzzjoni hija kombinazzjoni ta 'acridine orange (it-tebgħa ta' aċidu nuklejku aħdar-fluworexxenti) u propidium iodide (it-tebgħa ta 'aċidu nuklejku aħmar-fluworexxenti).Il-jodur tal-propidju (PI) huwa żebgħa tal-esklużjoni tal-membrana li tidħol biss fiċ-ċelloli b'membrani kompromessi, filwaqt li l-oranġjo tal-acridine huwa kapaċi jippenetra ċ-ċelloli kollha f'popolazzjoni.Meta ż-żewġ żebgħat huma preżenti fin-nukleu, jodur tal-propidju jikkawża tnaqqis fil-fluworexxenza oranġjo tal-acridine permezz tat-trasferiment tal-enerġija tar-reżonanza tal-fluworexxenza (FRET).Bħala riżultat, ċelluli nukleati b'membrani intatti tebgħu fl-aħdar fluworexxenti u jingħaddu bħala ħajjin, filwaqt li ċelloli nukleati b'membrani kompromessi jtebbgħu biss aħmar fluworexxenti u jingħaddu bħala mejta meta tuża s-sistema Countstar® FL.Materjal mhux nukleat bħal ċelluli ħomor tad-demm, plejtlits u debris ma jiffluworexxewx u huma injorati mis-softwer Countstar® FL.
Proċedura Sperimentali:
1.Iddilwixxi l-kampjun PBMC f'5 konċentrazzjonijiet differenti b'PBS;
2.Żid 12µl soluzzjoni AO/PI f'kampjun ta '12µl, imħallat bil-mod mal-pipetta;
3.Iġbed 20µl taħlita fis-slide tal-kamra;
4.Ħalli ċ-ċelloli joqgħodu fil-kamra għal madwar minuta 1;
5.Insect is-slide fl-istrument Countstar FL;
6.Agħżel l-assaġġ "AO/PI Viability", imbagħad ittestja minn Countstar FL.
Attenzjoni: AO u PI huma karċinoġenu potenzjali.Huwa rakkomandat li l-operatur jilbes tagħmir protettiv personali (PPE) biex jevita kuntatt dirett mal-ġilda u l-għajnejn.
Riżultat:
1.Qasam Bright u Stampi Fluworexxenti tal-PBMC
Iż-żebgħa AO u PI huma t-tnejn tbajja tad-DNA fin-nukleu taċ-ċelluli taċ-ċelloli.Għalhekk, il-plejtlits, iċ-ċelluli ħomor tad-demm jew id-debris ċellulari ma jistgħux jaffettwaw il-konċentrazzjoni u r-riżultat tal-vijabbiltà tal-PBMCs.Ċelloli ħajjin, ċelluli mejta u debris jistgħu jiġu distinti faċilment bażi fuq l-immaġini ġġenerati minn Countstar FL (Figura 1).
Figura 2.Qasam Bright u Stampi Fluworexxenti tal-PBMC
2.Konċentrazzjoni u Vijabilità tal-PBMC
Il-kampjuni tal-PBMC ġew dilwiti f'2, 4, 8 u 16-il darba b'PBS, imbagħad dawk il-kampjuni ġew inkubati b'taħlita taż-żebgħa AO/PI u analizzati minn Countstar FL rispettivament.Ir-riżultat tal-konċentrazzjoni u l-vijabbiltà tal-PBMC jintwera kif jidher hawn taħt:
