પેરિફેરલ બ્લડ મોનોન્યુક્લિયર કોશિકાઓ (PBMCs) ને ઘનતા ગ્રેડિયન્ટ સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા આખા રક્તથી અલગ કરવા માટે ઘણીવાર પ્રક્રિયા કરવામાં આવે છે.તે કોષોમાં લિમ્ફોસાઇટ્સ (ટી કોશિકાઓ, બી કોશિકાઓ, એનકે કોશિકાઓ) અને મોનોસાઇટ્સનો સમાવેશ થાય છે, જે સામાન્ય રીતે ઇમ્યુનોલોજી, સેલ થેરાપી, ચેપી રોગ અને રસીના વિકાસના ક્ષેત્રમાં વપરાય છે.તબીબી પ્રયોગશાળાઓ, મૂળભૂત તબીબી વિજ્ઞાન સંશોધન અને રોગપ્રતિકારક કોષોના ઉત્પાદન માટે PBMC ની કાર્યક્ષમતા અને સાંદ્રતાનું નિરીક્ષણ અને વિશ્લેષણ કરવું મહત્વપૂર્ણ છે.
ફિગ 1. ડેન્સિટી ગ્રેડિયન્ટ સેન્ટ્રીફ્યુગેશન સાથે તાજા લોહીમાંથી પીબીએમસીને અલગ કરે છે
AOPI ડ્યુઅલ-ફ્લોરેસેસ કાઉન્ટિંગ એ કોષની સાંદ્રતા અને સદ્ધરતા શોધવા માટે વપરાતો એસે પ્રકાર છે.સોલ્યુશન એક્રિડાઇન ઓરેન્જ (લીલો-ફ્લોરોસન્ટ ન્યુક્લીક એસિડ સ્ટેન) અને પ્રોપીડિયમ આયોડાઇડ (લાલ-ફ્લોરોસન્ટ ન્યુક્લીક એસિડ સ્ટેન) નું મિશ્રણ છે.પ્રોપિડીયમ આયોડાઇડ (PI) એ પટલનો બાકાત રંગ છે જે માત્ર ચેડા થયેલા પટલવાળા કોષોમાં પ્રવેશે છે, જ્યારે એક્રીડીન નારંગી વસ્તીના તમામ કોષોમાં પ્રવેશ કરવામાં સક્ષમ છે.જ્યારે બંને રંગો ન્યુક્લિયસમાં હાજર હોય છે, ત્યારે પ્રોપિડિયમ આયોડાઈડ ફ્લોરોસેન્સ રેઝોનન્સ એનર્જી ટ્રાન્સફર (FRET) દ્વારા એક્રીડિન ઓરેન્જ ફ્લોરોસેન્સમાં ઘટાડો કરે છે.પરિણામે, અખંડ પટલ સાથેના ન્યુક્લિએટેડ કોષો ફ્લોરોસન્ટ લીલા રંગના થાય છે અને તેને જીવંત તરીકે ગણવામાં આવે છે, જ્યારે ચેડા થયેલ પટલ સાથેના ન્યુક્લિએટેડ કોષો માત્ર ફ્લોરોસન્ટ લાલ રંગના જ ડાઘા કરે છે અને Countstar® FL સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરતી વખતે મૃત તરીકે ગણવામાં આવે છે.બિન-ન્યુક્લિએટેડ સામગ્રી જેમ કે લાલ રક્ત કોશિકાઓ, પ્લેટલેટ્સ અને ભંગાર ફ્લોરોસીસ થતા નથી અને Countstar® FL સોફ્ટવેર દ્વારા તેની અવગણના કરવામાં આવે છે.
પ્રાયોગિક પ્રક્રિયા:
1. PBMC નમૂનાને PBS સાથે 5 વિવિધ સાંદ્રતામાં પાતળું કરો;
2. 12µl AO/PI સોલ્યુશનને 12µl નમૂનામાં ઉમેરો, હળવેથી પીપેટ સાથે મિશ્રિત કરો;
3. ચેમ્બર સ્લાઇડમાં 20µl મિશ્રણ દોરો;
4. કોષોને લગભગ 1 મિનિટ માટે ચેમ્બરમાં સ્થાયી થવા દો;
5. કાઉન્ટસ્ટાર FL ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટમાં સ્લાઇડને જંતુ કરો;
6. "AO/PI સદ્ધરતા" એસે પસંદ કરો, પછી કાઉન્ટસ્ટાર FL દ્વારા પરીક્ષણ કરો.
સાવધાન: AO અને PI સંભવિત કાર્સિનોજેન છે.ત્વચા અને આંખો સાથે સીધો સંપર્ક ટાળવા માટે ઓપરેટરને વ્યક્તિગત રક્ષણાત્મક સાધનો (PPE) પહેરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.
પરિણામ:
1. PBMC ની તેજસ્વી ક્ષેત્ર અને ફ્લોરોસેન્સ છબીઓ
AO અને PI રંગ એ કોશિકાઓના સેલ ન્યુક્લિયસમાં બંને સ્ટેન ડીએનએ છે.તેથી, પ્લેટલેટ્સ, લાલ રક્ત કોશિકાઓ અથવા સેલ્યુલર કચરો PBMCs એકાગ્રતા અને કાર્યક્ષમતા પરિણામને અસર કરવામાં અસમર્થ છે.જીવંત કોષો, મૃત કોષો અને કાટમાળને કાઉન્ટસ્ટાર એફએલ (આકૃતિ 1) દ્વારા બનાવવામાં આવેલી છબીઓના આધારે સરળતાથી ઓળખી શકાય છે.
આકૃતિ 2. PBMC ની તેજસ્વી ક્ષેત્ર અને ફ્લોરોસેન્સ છબીઓ
2. PBMC ની એકાગ્રતા અને કાર્યક્ષમતા
PBMC નમૂનાઓને PBS સાથે 2, 4, 8 અને 16 વખત ભેળવવામાં આવ્યા હતા, ત્યારબાદ તે નમૂનાઓને AO/PI ડાય મિશ્રણ સાથે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા અને કાઉન્ટસ્ટાર FL દ્વારા અનુક્રમે વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.PBMC ની એકાગ્રતા અને કાર્યક્ષમતાનું પરિણામ નીચેની આકૃતિમાં દર્શાવવામાં આવ્યું છે:
