Perifera mononukleära blodceller (PBMC) bearbetas ofta för att separeras från helblod genom densitetsgradientcentrifugering.Dessa celler består av lymfocyter (T-celler, B-celler, NK-celler) och monocyter, som vanligtvis används inom området immunologi, cellterapi, infektionssjukdomar och vaccinutveckling.Övervakning och analys av livsduglighet och koncentration av PBMC är avgörande för de kliniska laboratorierna, grundläggande medicinsk forskning och produktion av immunceller.
Fig 1. Isolerad PBMC från färskt blod med densitetsgradientcentrifugering
AOPI Dual-fluoresces counting är den analystyp som används för att detektera cellkoncentration och livsduglighet.Lösningen är en kombination av akridin orange (den grönfluorescerande nukleinsyrafärgen) och propidiumjodid (den rödfluorescerande nukleinsyrafärgen).Propidiumjodid (PI) är ett membranexklusionsfärgämne som endast kommer in i celler med skadade membran, medan akridin orange kan penetrera alla celler i en population.När båda färgämnena är närvarande i kärnan orsakar propidiumjodid en minskning av akridin-orange fluorescens genom fluorescensresonansenergiöverföring (FRET).Som ett resultat färgas kärnförsedda celler med intakta membran fluorescerande grönt och räknas som levande, medan kärnförsedda celler med komprometterade membran endast färgas fluorescerande rött och räknas som döda när Countstar® FL-systemet används.Material som inte innehåller kärnor som röda blodkroppar, blodplättar och skräp fluorescerar inte och ignoreras av programvaran Countstar® FL.
Experimentell procedur:
1. Späd PBMC-provet till 5 olika koncentrationer med PBS;
2. Tillsätt 12 µl AO/PI-lösning i 12 µl prov, försiktigt blandat med pipett;
3. Dra upp 20 µl blandning i kammarglaset;
4. Låt cellerna sätta sig i kammaren i cirka 1 minut;
5. Insektera objektglaset i Countstar FL-instrumentet;
6.Välj analysen "AO/PI Viability" och testa sedan med Countstar FL.
Varning: AO och PI är potentiellt cancerframkallande.Det rekommenderas att operatören bär personlig skyddsutrustning (PPE) för att undvika direkt kontakt med hud och ögon.
Resultat:
1. Ljusfälts- och fluorescensbilder av PBMC
AO- och PI-färgämnet är båda färgnings-DNA i cellkärnan i celler.Därför kan trombocyter, röda blodkroppar eller cellrester inte påverka PBMCs koncentration och livskraftsresultat.Levande celler, döda celler och skräp kan lätt urskiljas baserat på bilderna som genereras av Countstar FL (Figur 1).
Figur 2．Ljusfält och fluorescensbilder av PBMC
2. Koncentration och livskraft för PBMC
PBMC-proverna späddes ut 2, 4, 8 och 16 gånger med PBS, sedan inkuberades dessa prover med en AO/PI-färgblandning och analyserades med Countstar FL respektive.Resultatet av koncentration och livsduglighet av PBMC visas som nedanstående figur:
