У дома » Ресурси » AO PI двойна флуоресценция, анализираща концентрацията и жизнеспособността на PBMC

AO PI двойна флуоресценция, анализираща концентрацията и жизнеспособността на PBMC

Мононуклеарните клетки на периферната кръв (PBMCs) често се обработват, за да се отделят от цяла кръв чрез центрофугиране с градиент на плътност.Тези клетки се състоят от лимфоцити (Т клетки, В клетки, NK клетки) и моноцити, които обикновено се използват в областта на имунологията, клетъчната терапия, инфекциозните заболявания и разработването на ваксини.Мониторингът и анализирането на жизнеспособността и концентрацията на PBMC е от решаващо значение за клиничните лаборатории, основните медицински научни изследвания и производството на имунни клетки.

 

Фигура 1. Изолиран PBMC от прясна кръв с центрофугиране с градиент на плътност

 

AOPI двойно-флуоресцентно броене е типът анализ, използван за откриване на клетъчна концентрация и жизнеспособност.Разтворът е комбинация от акридиново оранжево (зелено-флуоресцентно оцветяване на нуклеинова киселина) и пропидиев йодид (червено-флуоресцентно оцветяване с нуклеинова киселина).Пропидиев йодид (PI) е багрило за изключване на мембраната, което влиза само в клетки с компрометирани мембрани, докато акридин портокалът е в състояние да проникне във всички клетки в популацията.Когато и двете багрила присъстват в ядрото, пропидиевият йодид причинява намаляване на акридиново оранжевата флуоресценция чрез флуоресцентен резонансен пренос на енергия (FRET).В резултат на това клетките с ядра с непокътнати мембрани оцветяват флуоресцентно зелено и се считат за живи, докато нуклеираните клетки с компрометирани мембрани оцветяват само флуоресцентно червено и се броят като мъртви, когато се използва системата Countstar® FL.Безядрени материали като червени кръвни клетки, тромбоцити и остатъци не флуоресцират и се игнорират от софтуера Countstar® FL.

 

Експериментална процедура:

1.Разредете PBMC пробата в 5 различни концентрации с PBS;
2. Добавете 12 µl AO/PI разтвор в 12 µl проба, внимателно разбъркайте с пипета;
3. Изтеглете 20 µl смес в предметно стъкло;
4. Оставете клетките да се утаят в камерата за около 1 минута;
5. Инсектирайте пързалката в инструмента Countstar FL;
6. Изберете анализа „AO/PI Viability“ и след това тествайте от Countstar FL.

Внимание: AO и PI са потенциален канцероген.Препоръчва се операторът да носи лични предпазни средства (ЛПС), за да избегне директен контакт с кожата и очите.

 

Резултат:

1. Ярко поле и флуоресцентни изображения на PBMC

И двете багрила AO и PI оцветяват ДНК в клетъчното ядро ​​на клетките.Следователно тромбоцитите, червените кръвни клетки или клетъчните остатъци не могат да повлияят на концентрацията на PBMC и резултата от жизнеспособността.Живите клетки, мъртвите клетки и остатъците могат лесно да бъдат разграничени въз основа на изображенията, генерирани от Countstar FL (Фигура 1).

 

Фигура 2. Ярко поле и флуоресцентни изображения на PBMC

 

2. Концентрация и жизнеспособност на PBMC

PBMC пробите се разреждат 2, 4, 8 и 16 пъти с PBS, след което тези проби се инкубират със смес от багрила AO/PI и се анализират съответно от Countstar FL.Резултатът от концентрацията и жизнеспособността на PBMC е показан на фигурата по-долу:

 

Фигура 3. Жизнеспособност и концентрация на РВМС в пет различни проби.(а).Разпределението на жизнеспособността на различни проби.(б) Линейната връзка на общата клетъчна концентрация между различните проби.(в) Линейната връзка на концентрацията на живи клетки между различните проби.

 

 

 

 

 

 

Изтегли

Изтегляне на файл

  • 这个字段是用于验证目的,应该保持不变。

Вашата поверителност е важна за нас.

Ние използваме бисквитки, за да подобрим вашето изживяване при посещение на нашите уебсайтове: бисквитките за ефективност ни показват как използвате този уебсайт, функционалните бисквитки запомнят вашите предпочитания и бисквитките за насочване ни помагат да споделяме подходящо за вас съдържание.

Приемам

Влизам