Мононуклеарне ћелије периферне крви (ПБМЦ) се често обрађују да се одвоје од пуне крви центрифугирањем у градијенту густине.Те ћелије се састоје од лимфоцита (Т ћелије, Б ћелије, НК ћелије) и моноцита, који се обично користе у области имунологије, ћелијске терапије, заразних болести и развоја вакцина.Праћење и анализа одрживости и концентрације ПБМЦ је од кључног значаја за клиничке лабораторије, основна медицинска научна истраживања и производњу имуних ћелија.
Слика 1. Изоловани ПБМЦ из свеже крви центрифугирањем са градијентом густине
АОПИ Дуал-флуоресцент цоунтинг је тип теста који се користи за откривање концентрације и одрживости ћелија.Решење је комбинација акридин наранџе (зелена флуоресцентна боја нуклеинске киселине) и пропидијум јодида (црвена флуоресцентна боја нуклеинске киселине).Пропидијум јодид (ПИ) је боја за искључивање мембране која улази само у ћелије са угроженим мембранама, док акридин наранџаста може да продре у све ћелије у популацији.Када су обе боје присутне у језгру, пропидијум јодид изазива смањење флуоресценције акридин наранџасте боје преносом енергије флуоресцентне резонанце (ФРЕТ).Као резултат тога, ћелије са једром са нетакнутим мембранама боје се флуоресцентно зеленом бојом и рачунају се као живе, док ћелије са језгром са угроженим мембранама боје само флуоресцентно црвено и рачунају се као мртве када се користи Цоунтстар® ФЛ систем.Материјали без језгре као што су црвена крвна зрнца, тромбоцити и остаци не флуоресцирају и игноришу их софтвер Цоунтстар® ФЛ.
Експериментални поступак:
1. Разблажите узорак ПБМЦ у 5 различитих концентрација са ПБС;
2.Додајте 12 µл АО/ПИ раствора у 12 µл узорка, нежно помешајте пипетом;
3. Увуците 20 µл смеше у предметно стакло;
4. Дозволите ћелијама да се слегну у комори око 1 минут;
5.Убаците клизач у инструмент Цоунтстар ФЛ;
6. Изаберите „АО/ПИ Виабилити” тест, а затим га тестирајте од стране Цоунтстар ФЛ.
Опрез: АО и ПИ су потенцијални канцероген.Препоручује се да оператер носи личну заштитну опрему (ППЕ) како би избегао директан контакт са кожом и очима.
резултат:
1. Светло поље и флуоресцентне слике ПБМЦ
Боје АО и ПИ обојене су ДНК у ћелијском језгру ћелија.Због тога, тромбоцити, црвена крвна зрнца или ћелијски остаци не могу да утичу на концентрацију ПБМЦ и резултат одрживости.Живе ћелије, мртве ћелије и остаци могу се лако разликовати на основу слика које генерише Цоунтстар ФЛ (Слика 1).
Слика 2. Светло поље и слике флуоресценције ПБМЦ
2. Концентрација и одрживост ПБМЦ
Узорци ПБМЦ су разблажени 2, 4, 8 и 16 пута са ПБС, затим су ти узорци инкубирани са мешавином АО/ПИ боје и анализирани од стране Цоунтстар ФЛ респективно.Резултат концентрације и одрживости ПБМЦ-а је приказан на слици испод:
