Перифериялық қанның мононуклеарлы жасушалары (ПБМК) тығыздық градиенті центрифугалау арқылы тұтас қаннан бөлу үшін жиі өңделеді.Бұл жасушалар иммунология, жасушалық терапия, жұқпалы аурулар және вакцина жасау саласында кеңінен қолданылатын лимфоциттерден (Т жасушалары, В жасушалары, NK жасушалары) және моноциттерден тұрады.ПБМК өміршеңдігі мен концентрациясын бақылау және талдау клиникалық зертханалар, іргелі медицина ғылымының зерттеулері және иммундық жасушалардың өндірісі үшін өте маңызды.
1-сурет. Тығыздық градиентті центрифугалау арқылы жаңа қаннан оқшауланған PBMC
AOPI қос флуоресцентті санау - жасуша концентрациясы мен өміршеңдігін анықтау үшін қолданылатын талдау түрі.Ерітінді акридин апельсин (жасыл-флуоресцентті нуклеин қышқылы дақ) және пропидий йодид (қызыл-флуоресцентті нуклеин қышқылы дақ) қосындысы болып табылады.Пропидий йодид (PI) - мембранадан шығарылатын бояғыш, ол тек мембранасы бұзылған жасушаларға енеді, ал акридин апельсин популяциядағы барлық жасушаларға енеді.Екі бояғыш ядрода болған кезде, пропидий йодид флуоресценциялық резонансты энергияны тасымалдау (FRET) арқылы акридинді қызғылт сары флуоресценцияның төмендеуін тудырады.Нәтижесінде мембранасы бұзылмаған ядросы бар жасушалар флуоресцентті жасыл түске боялады және тірі болып саналады, ал қабығы бұзылған ядролы жасушалар тек флуоресцентті қызыл түске боялады және Countstar® FL жүйесін пайдаланған кезде өлі болып есептеледі.Эритроциттер, тромбоциттер және қоқыстар сияқты ядросыз материал флуоресценттенбейді және оларды Countstar® FL бағдарламалық құралы елемейді.
Эксперименттік процедура:
1. PBMC үлгісін PBS көмегімен 5 түрлі концентрацияға сұйылтыңыз;
2. Тамшуырмен ақырын араластырылған 12 мкл үлгіге 12 мкл AO/PI ерітіндісін қосыңыз;
3. Камера слайдына 20 мкл қоспаны салыңыз;
4.Жасушалардың камерада шамамен 1 минут тұруына рұқсат етіңіз;
5. Слайдты Countstar FL құралына салыңыз;
6. “AO/PI Viability” талдауын таңдаңыз, содан кейін Countstar FL арқылы сынаңыз.
Абайлаңыз: AO және PI ықтимал канцероген болып табылады.Теріге және көзге тікелей тиіп кетпеу үшін операторға жеке қорғаныс құралдарын (ЖҚҚ) кию ұсынылады.
Нәтиже:
1. PBMC-тің жарқын өріс және флуоресценция кескіндері
AO және PI бояғыштары жасушалардың жасуша ядросындағы ДНҚ дақтары болып табылады.Сондықтан тромбоциттер, қызыл қан жасушалары немесе жасушалық қалдықтар PBMC концентрациясына және өміршеңдік нәтижесіне әсер ете алмайды.Тірі жасушаларды, өлі жасушаларды және қалдықтарды Countstar FL жасаған кескіндер негізінде оңай ажыратуға болады (1-сурет).
2-сурет．PBMC-тің жарқын өріс және флуоресценция кескіндері
2. ПБМК концентрациясы және өміршеңдігі
PBMC үлгілері PBS көмегімен 2, 4, 8 және 16 рет сұйылтылған, содан кейін бұл үлгілер AO/PI бояғыш қоспасымен инкубацияланған және сәйкесінше Countstar FL арқылы талданған.ПБМК концентрациясы мен өміршеңдігінің нәтижесі төмендегі суретте көрсетілген:
