A perifériás vér mononukleáris sejtjeit (PBMC) gyakran sűrűséggradiens centrifugálással különítik el a teljes vértől.Ezek a sejtek limfocitákból (T-sejtek, B-sejtek, NK-sejtek) és monocitákból állnak, amelyeket általában az immunológia, sejtterápia, fertőző betegségek és vakcinafejlesztés területén használnak.A PBMC életképességének és koncentrációjának monitorozása és elemzése kulcsfontosságú a klinikai laboratóriumok, az orvostudományi alapkutatások és az immunsejt-termelés szempontjából.
1. ábra: Friss vérből izolált PBMC sűrűséggradiens centrifugálással
Az AOPI kettős fluoreszcens számlálás a sejtkoncentráció és életképesség kimutatására használt vizsgálati típus.Az oldat az akridinnarancs (a zölden fluoreszkáló nukleinsav festés) és a propidium-jodid (a vörös fluoreszcens nukleinsav festés) kombinációja.A propidium-jodid (PI) egy membránkizáró festék, amely csak a sérült membránnal rendelkező sejtekbe jut be, míg az akridinnarancs képes behatolni a populáció összes sejtjébe.Ha mindkét színezék jelen van a sejtmagban, a propidium-jodid csökkenti az akridinnarancs fluoreszcenciáját a fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer (FRET) révén.Ennek eredményeként az ép membránnal rendelkező magos sejtek fluoreszkáló zöldre festődnek, és élőnek számítanak, míg a károsodott membránnal rendelkező magos sejtek csak fluoreszkáló vörösre festődnek, és a Countstar® FL rendszer használatakor elhaltnak számítanak.A mag nélküli anyagok, mint például a vörösvértestek, vérlemezkék és törmelékek nem fluoreszkálnak, és a Countstar® FL szoftver figyelmen kívül hagyja őket.
Kísérleti eljárás:
1. Hígítsa fel a PBMC-mintát 5 különböző koncentrációra PBS-sel;
2. Adjon 12 µl AO/PI oldatot 12 µl mintához, óvatosan keverje össze pipettával;
3. Húzzunk 20 µl keveréket a kamra tárgylemezére;
4. Hagyja, hogy a cellák körülbelül 1 percig leülepedjenek a kamrában;
5. Rovarozza be a tárgylemezt a Countstar FL műszerbe;
6. Válassza ki az „AO/PI Viability” tesztet, majd tesztelje a Countstar FL-el.
Figyelem: Az AO és a PI potenciálisan rákkeltő anyagok.Javasoljuk, hogy a kezelő személyi védőfelszerelést (PPE) viseljen, hogy elkerülje a bőrrel és szemmel való közvetlen érintkezést.
Eredmény:
1. Fényes mező és fluoreszcens képek a PBMC-ről
Az AO és a PI festék egyaránt megfesti a DNS-t a sejtek sejtmagjában.Ezért a vérlemezkék, a vörösvérsejtek vagy a sejttörmelékek nem képesek befolyásolni a PBMC-k koncentrációját és életképességét.Az élő sejtek, az elhalt sejtek és a törmelék könnyen megkülönböztethetőek a Countstar FL által generált képek alapján (1. ábra).
2. ábra: Fényes mező és fluoreszcens képek a PBMC-ről
2. A PBMC koncentrációja és életképessége
A PBMC mintákat 2, 4, 8 és 16-szorosra hígítottuk PBS-sel, majd AO/PI festékkeverékkel inkubáltuk, és Countstar FL-el analizáltuk.A PBMC koncentrációjának és életképességének eredményét az alábbi ábra mutatja:
