Sel mononuklear darah perifer (PBMC) sering diproses untuk dipisahkan dari darah utuh dengan sentrifugasi gradien densitas.Sel-sel tersebut terdiri dari limfosit (sel T, sel B, sel NK) dan monosit, yang biasa digunakan dalam bidang imunologi, terapi sel, penyakit menular dan pengembangan vaksin.Pemantauan dan analisis viabilitas dan konsentrasi PBMC sangat penting untuk laboratorium klinis, penelitian ilmu kedokteran dasar, dan produksi sel kekebalan.
Gambar 1. Isolasi PBMC dari darah segar dengan sentrifugasi gradien Kepadatan
Penghitungan fluoresensi ganda AOPI adalah jenis pengujian yang digunakan untuk mendeteksi konsentrasi dan viabilitas sel.Solusinya adalah kombinasi acridine orange (pewarnaan asam nukleat fluoresen hijau) dan propidium iodida (pewarnaan asam nukleat fluoresen merah).Propidium iodide (PI) adalah pewarna eksklusi membran yang hanya memasuki sel dengan membran terganggu, sedangkan acridine orange mampu menembus semua sel dalam suatu populasi.Ketika kedua pewarna hadir dalam nukleus, propidium iodida menyebabkan pengurangan fluoresensi jingga acridine oleh transfer energi resonansi fluoresensi (FRET).Akibatnya, sel berinti dengan membran utuh menodai hijau fluoresen dan dihitung sebagai hidup, sedangkan sel berinti dengan membran terganggu hanya menodai merah fluoresen dan dihitung mati saat menggunakan sistem Countstar® FL.Bahan tidak berinti seperti sel darah merah, trombosit, dan serpihan tidak berpendar dan diabaikan oleh perangkat lunak Countstar® FL.
Prosedur percobaan:
1. Encerkan sampel PBMC menjadi 5 konsentrasi berbeda dengan PBS;
2. Tambahkan larutan AO/PI 12µl ke dalam sampel 12µl, aduk perlahan dengan pipet;
3.Draw 20µl campuran ke dalam ruang slide;
4.Biarkan sel mengendap di dalam ruangan selama sekitar 1 menit;
5. Serangkai slide ke instrumen Countstar FL;
6.Pilih uji “Kelayakan AO/PI”, lalu uji dengan Countstar FL.
Perhatian: AO dan PI adalah karsinogen potensial.Disarankan agar operator memakai alat pelindung diri (APD) untuk menghindari kontak langsung dengan kulit dan mata.
Hasil:
1.Bright Field dan gambar Fluoresensi dari PBMC
Pewarna AO dan PI keduanya mewarnai DNA dalam inti sel sel.Oleh karena itu, Trombosit, sel darah merah, atau puing-puing seluler tidak dapat mempengaruhi konsentrasi dan hasil viabilitas PBMC.Sel hidup, sel mati dan puing-puing dapat dengan mudah dibedakan berdasarkan gambar yang dihasilkan oleh Countstar FL (Gambar 1).
Gambar 2 Gambar Bidang Terang dan Fluoresensi PBMC
2. Konsentrasi dan Viabilitas PBMC
Sampel PBMC diencerkan dalam 2, 4, 8 dan 16 kali dengan PBS, kemudian sampel tersebut diinkubasi dengan campuran pewarna AO/PI dan dianalisis masing-masing dengan Countstar FL.Hasil konsentrasi dan viabilitas PBMC ditunjukkan sebagai berikut:
