תאי דם חד-גרעיניים (PBMCs) מעובדים לעתים קרובות להפרדה מדם מלא על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות.תאים אלה מורכבים מלימפוציטים (תאי T, תאי B, תאי NK) וממונוציטים, המשמשים בדרך כלל בתחום האימונולוגיה, טיפול בתאים, מחלות זיהומיות ופיתוח חיסונים.ניטור וניתוח הכדאיות והריכוז של PBMC חיוניים עבור המעבדות הקליניות, מחקר מדעי רפואי בסיסי וייצור תאי חיסון.
איור 1. PBMC מבודד מדם טרי עם צנטריפוגה שיפוע צפיפות
ספירת AOPI Dual-fluoresces היא סוג הבדיקה המשמש לזיהוי ריכוז תאים וכדאיות.הפתרון הוא שילוב של אקרידין כתום (כתם חומצת הגרעין הירוק-ניאון) ופרופידיום יודיד (כתם חומצת הגרעין האדומה-ניאון).Propidium iodide (PI) הוא צבע אי הכללת ממברנה שנכנס רק לתאים עם ממברנות פגומות, בעוד אקרידין כתום מסוגל לחדור לכל התאים באוכלוסייה.כאשר שני הצבעים נמצאים בגרעין, יודיד פרופידיום גורם להפחתה של הקרינה הכתומה של אקרידין על ידי העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET).כתוצאה מכך, תאים בעלי גרעין עם ממברנות שלמות צובעים בירוק ניאון ונספרים כחיים, בעוד שתאים בעלי גרעין עם ממברנות נפגעות צובעים רק באדום ניאון ונספרים כמתים בעת שימוש במערכת Countstar® FL.חומר שאינו בעל גרעין כגון תאי דם אדומים, טסיות דם ופסולת אינם מקרינים ומתעלמים מהם על ידי תוכנת Countstar® FL.
הליך ניסיוני:
1.דילול את מדגם PBMC לתוך 5 ריכוזים שונים עם PBS;
2. הוסף תמיסת AO/PI של 12µl לתוך מדגם 12µl, מעורבב בעדינות עם פיפטה;
3. צייר תערובת של 20µl לתוך שקופית החדר;
4. אפשר לתאים להתיישב בתא למשך כדקה אחת;
5. חרקים את השקופית לתוך מכשיר Countstar FL;
6. בחר במבחן "AO/PI Viability", ולאחר מכן בדוק על ידי Countstar FL.
זהירות: AO ו-PI הם חומר מסרטן פוטנציאלי.מומלץ שהמפעיל ילבש ציוד מגן אישי (PPE) כדי להימנע ממגע ישיר עם העור והעיניים.
תוֹצָאָה:
1. Bright Field ותמונות פלואורסצנטיות של ה-PBMC
צבעי AO ו-PI הם שניהם מכתים DNA בגרעין התא של התאים.לכן, טסיות דם, תאי דם אדומים או פסולת תאים אינם מסוגלים להשפיע על ריכוז PBMC ועל תוצאת הכדאיות.ניתן להבחין בקלות בין תאים חיים, תאים מתים ופסולת על בסיס התמונות שנוצרו על ידי Countstar FL (איור 1).
איור 2. תמונות שדה בהיר ופלורסנטיות של ה-PBMC
2.ריכוז וכדאיות של PBMC
דגימות ה-PBMC הודללו ב-2, 4, 8 ו-16 פעמים עם PBS, ואז הדגימות הללו הודגרו עם תערובת צבע AO/PI ונותחו על ידי Countstar FL בהתאמה.התוצאה של ריכוז וכדאיות של PBMC מוצגת באיור שלהלן:
