Odol periferikoko zelula mononuklearrak (PBMC) sarritan prozesatzen dira odol osotik bereizteko dentsitate gradientearen zentrifugazioaren bidez.Zelula horiek linfozitoek (T zelulak, B zelulak, NK zelulak) eta monozitoek osatzen dituzte, immunologia, terapia zelularra, gaixotasun infekziosoak eta txertoen garapenean erabili ohi direnak.PBMCren bideragarritasuna eta kontzentrazioa kontrolatzea eta aztertzea funtsezkoa da laborategi klinikoetarako, oinarrizko zientzia medikoen ikerketarako eta zelula immunologikoetarako.
1. irudia. PBMC isolatua odol freskotik Dentsitate gradientearen zentrifugazioarekin
AOPI Fluoresze bikoitzeko zenbaketa zelulen kontzentrazioa eta bideragarritasuna detektatzeko erabiltzen den saiakuntza mota da.Soluzioa akridina laranja (azido nukleiko berde-fluoreszentea) eta propidio ioduroa (azido nukleiko gorri-fluoreszentea) konbinazioa da.Propidio ioduroa (PI) mintza baztertzeko koloratzaile bat da, mintz arriskutsuak dituzten zeluletan soilik sartzen dena, eta akridina laranja populazio bateko zelula guztietan sartzeko gai den bitartean.Bi koloratzaileak nukleoan daudenean, propidio ioduroak akridina laranja fluoreszentzia murriztea eragiten du fluoreszentzia erresonantzia energia transferentziaren bidez (FRET).Ondorioz, mintz osorik duten zelula nukleatuek berdez fluoreszentea zikindu eta bizi gisa zenbatzen dira, eta mintza konprometitua duten zelula nukleatuek gorriz fluoreszentea baino ez dute zikindu eta Countstar® FL sistema erabiltzean hildako gisa zenbatzen dira.Nukleatu gabeko materialak, esate baterako, globulu gorriak, plaketak eta hondakinak ez dira fluoreskatzen eta Countstar® FL softwareak ez du aintzat hartzen.
Prozedura esperimentala:
1.Diluitu PBMC lagina 5 kontzentrazio ezberdinetan PBSrekin;
2.Gehitu 12 µl AO/PI disoluzioa 12 µl lagin batean, astiro-astiro pipetarekin nahastuta;
3.Marraztu 20µl nahasketa ganberako diapositiba batean;
4.Utzi zelulak ganberan finkatzen minutu 1 inguruan;
5.Intsektatu diapositiba Countstar FL tresnan;
6.Aukeratu "AO/PI Bideragarritasuna" saiakuntza, eta probatu Countstar FL-k.
Kontuz: AO eta PI potentzial kartzinogenoa da.Eragileak babes pertsonaleko ekipamendua (PPE) eramatea gomendatzen da, larruazala eta begiekin zuzenean ukitzea ekiditeko.
Emaitza:
1. Eremu distiratsua eta fluoreszentzia-irudiak PBMCren
AO eta PI koloratzaileak zelulen zelulen nukleoko DNA orbanak dira.Beraz, plaketak, globulu gorriak edo hondakin zelularrak ezin dira PBMCen kontzentrazioan eta bideragarritasunaren emaitzan eragin.Zelula biziak, hildako zelulak eta hondakinak erraz bereiz daitezke Countstar FL-k sortutako irudietan oinarrituta (1. irudia).
2. irudia. Eremu distiratsua eta fluoreszentzia-irudiak PBMCren
2.PBMCren kontzentrazioa eta bideragarritasuna
PBMC laginak 2, 4, 8 eta 16 aldiz diluitu ziren PBSrekin, ondoren lagin horiek AO/PI koloratzaile nahasketa batekin inkubatu eta Countstar FL-k aztertu zituen hurrenez hurren.PBMCren kontzentrazio eta bideragarritasunaren emaitza beheko irudian erakusten da:
