Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) genellikle yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile tam kandan ayrılmak için işlenir.Bu hücreler, immünoloji, hücre tedavisi, bulaşıcı hastalık ve aşı geliştirme alanında yaygın olarak kullanılan lenfositler (T hücreleri, B hücreleri, NK hücreleri) ve monositlerden oluşur.PBMC'nin canlılığını ve konsantrasyonunu izlemek ve analiz etmek, klinik laboratuvarlar, temel tıp bilimi araştırmaları ve bağışıklık hücresi üretimi için çok önemlidir.
Şekil 1. Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile taze kandan izole edilmiş PBMC
AOPI Çift floresan sayımı, hücre konsantrasyonunu ve canlılığını saptamak için kullanılan tahlil tipidir.Çözüm, akridin portakalı (yeşil-floresan nükleik asit boyası) ve propidium iyodür (kırmızı-floresan nükleik asit boyası) kombinasyonudur.Propidium iyodür (PI), akridin portakalı bir popülasyondaki tüm hücrelere nüfuz edebilirken, yalnızca zarları bozulmuş hücrelere giren bir zar dışlama boyasıdır.Çekirdekte her iki boya da bulunduğunda, propidyum iyodür, flüoresans rezonans enerji transferi (FRET) ile akridin turuncu flüoresansında bir azalmaya neden olur.Sonuç olarak, zarları bozulmamış çekirdekli hücreler floresan yeşili boyar ve canlı olarak sayılırken, zarları bozulmuş çekirdekli hücreler yalnızca floresan kırmızısı boyar ve Countstar® FL sistemini kullanırken ölü olarak sayılır.Kırmızı kan hücreleri, trombositler ve kalıntılar gibi çekirdeksiz materyaller floresan yaymaz ve Countstar® FL yazılımı tarafından göz ardı edilir.
Deneysel prosedür:
1.PBMC örneğini PBS ile 5 farklı konsantrasyonda seyreltin;
2. 12µl numuneye 12µl AO/PI solüsyonu ekleyin, pipetle hafifçe karıştırın;
3. 20µl karışımı hazne slaytına çekin;
4. Hücrelerin yaklaşık 1 dakika odaya yerleşmesine izin verin;
5. Slaytı Countstar FL cihazına yerleştirin;
6.“AO/PI Viability” testini seçin, ardından Countstar FL ile test edin.
Dikkat: AO ve PI potansiyel bir kanserojendir.Operatörün cilt ve gözlerle doğrudan temastan kaçınmak için kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanması önerilir.
Sonuç:
1. PBMC'nin Parlak Alan ve Floresan görüntüleri
AO ve PI boyası, hücrelerin hücre çekirdeğindeki DNA'yı boyar.Bu nedenle, trombositler, kırmızı kan hücreleri veya hücresel kalıntılar, PBMC konsantrasyonunu ve canlılık sonucunu etkileyemez.Canlı hücreler, ölü hücreler ve kalıntılar, Countstar FL tarafından oluşturulan görüntülere dayanarak kolayca ayırt edilebilir (Şekil 1).
Şekil 2．PBMC'nin Parlak Alan ve Floresan görüntüleri
2.PBMC'nin Konsantrasyon ve Canlılığı
PBMC numuneleri 2, 4, 8 ve 16 kez PBS ile seyreltildi, ardından bu numuneler bir AO/PI boya karışımı ile inkübe edildi ve sırasıyla Countstar FL ile analiz edildi.PBMC konsantrasyonunun ve canlılığının sonucu aşağıdaki şekilde gösterilmiştir:
