Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) vengono spesso elaborate per separarsi dal sangue intero mediante centrifugazione in gradiente di densità.Tali cellule sono costituite da linfociti (cellule T, cellule B, cellule NK) e monociti, comunemente usati nel campo dell'immunologia, della terapia cellulare, delle malattie infettive e dello sviluppo di vaccini.Il monitoraggio e l'analisi della vitalità e della concentrazione di PBMC sono fondamentali per i laboratori clinici, la ricerca scientifica di base e la produzione di cellule immunitarie.
Fig 1. PBMC isolato da sangue fresco con centrifugazione in gradiente di densità
Il conteggio a doppia fluorescenza AOPI è il tipo di test utilizzato per rilevare la concentrazione e la vitalità cellulare.La soluzione è una combinazione di acridina arancione (il colorante verde fluorescente dell'acido nucleico) e ioduro di propidio (il colorante rosso fluorescente dell'acido nucleico).Lo ioduro di propidio (PI) è un colorante di esclusione della membrana che entra solo nelle cellule con membrane compromesse, mentre l'arancio di acridina è in grado di penetrare in tutte le cellule di una popolazione.Quando entrambi i coloranti sono presenti nel nucleo, lo ioduro di propidio provoca una riduzione della fluorescenza arancione di acridina mediante trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET).Di conseguenza, le cellule nucleate con membrane intatte si colorano di verde fluorescente e vengono conteggiate come vive, mentre le cellule nucleate con membrane compromesse si colorano solo di rosso fluorescente e vengono conteggiate come morte quando si utilizza il sistema Countstar® FL.I materiali non nucleati come globuli rossi, piastrine e detriti non emettono fluorescenza e vengono ignorati dal software Countstar® FL.
Procedura sperimentale:
1.Diluire il campione PBMC in 5 diverse concentrazioni con PBS;
2.Aggiungere 12 µl di soluzione AO/PI in 12 µl di campione, miscelare delicatamente con una pipetta;
3.Aspirare 20 µl di miscela nel vetrino della camera;
4.Lasciare che le cellule si depositino nella camera per circa 1 minuto;
5.Inserire il vetrino nello strumento Countstar FL;
6.Scegliere il test "AO/PI Viability", quindi testare con Countstar FL.
Attenzione: AO e PI sono un potenziale cancerogeno.Si raccomanda all'operatore di indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) per evitare il contatto diretto con la pelle e gli occhi.
Risultato:
1. Immagini in campo luminoso e fluorescenza del PBMC
Il colorante AO e PI sono entrambi coloranti del DNA nel nucleo cellulare delle cellule.Pertanto, piastrine, globuli rossi o detriti cellulari non sono in grado di influenzare la concentrazione di PBMC e il risultato di vitalità.Le cellule viventi, le cellule morte e i detriti possono essere facilmente distinti in base alle immagini generate da Countstar FL (Figura 1).
Figura 2．Immagini in campo luminoso e fluorescenza del PBMC
2. Concentrazione e vitalità di PBMC
I campioni di PBMC sono stati diluiti in 2, 4, 8 e 16 volte con PBS, quindi quei campioni sono stati incubati con una miscela di colorante AO/PI e analizzati rispettivamente da Countstar FL.Il risultato della concentrazione e della vitalità di PBMC è mostrato come nella figura seguente:
