Sel mononuklear getih perifer (PBMCs) asring diproses kanggo misahake saka getih wutuh kanthi sentrifugasi gradien kepadatan.Sel kasebut kalebu limfosit (sel T, sel B, sel NK) lan monosit, sing umum digunakake ing bidang imunologi, terapi sel, penyakit infèksius lan pangembangan vaksin.Ngawasi lan nganalisa viabilitas lan konsentrasi PBMC penting banget kanggo laboratorium klinis, riset ilmu medis dhasar lan produksi sel kekebalan.
Fig 1. Isolated PBMC saka getih seger karo Kapadhetan gradient centrifugation
AOPI Dual-fluoresces counting minangka jinis assay sing digunakake kanggo ndeteksi konsentrasi lan daya tahan sel.Solusi kasebut yaiku kombinasi oranye acridine (noda asam nukleat fluoresensi ijo) lan propidium iodide (noda asam nukleat neon abang).Propidium iodide (PI) minangka pewarna eksklusi membran sing mung mlebu ing sel kanthi membran sing rusak, dene oranye acridine bisa nembus kabeh sel ing sawijining populasi.Nalika loro pewarna kasebut ana ing inti, propidium iodide nyebabake nyuda fluoresensi oranye acridine kanthi transfer energi resonansi fluoresensi (FRET).Akibaté, sel nukleus karo membran utuh noda ijo fluoresensi lan dianggep minangka urip, dene sel nukleus karo membran sing rusak mung noda abang neon lan dianggep mati nalika nggunakake sistem Countstar® FL.Materi non-nukleat kayata sel getih abang, trombosit lan puing-puing ora fluoresensi lan ora digatekake dening piranti lunak Countstar® FL.
Prosedur Eksperimental:
1. Dilute sampel PBMC menyang 5 konsentrasi beda karo PBS;
2. Tambah 12μl AO/PI solusi menyang 12μl sampel, alon-alon dicampur karo pipette;
3. Tarik campuran 20µl menyang slide kamar;
4.Allow sel kanggo dumunung ing kamar kanggo watara 1 menit;
5. Serangga geser menyang instrumen Countstar FL;
6. Pilih tes "AO / PI Viability", banjur test dening Countstar FL.
Ati-ati: AO lan PI minangka karsinogen potensial.Disaranake operator nganggo peralatan pelindung pribadi (PPE) supaya ora kena langsung karo kulit lan mata.
asil:
1.Bright Field lan Gambar Fluoresensi saka PBMC
Pewarna AO lan PI minangka pewarna DNA ing inti sel sel.Mulane, Platelet, sel getih abang, utawa lebu sel ora bisa mengaruhi konsentrasi PBMC lan asil viabilitas.Sèl urip, sel mati lan lebu bisa gampang dibedakake adhedhasar gambar sing digawe dening Countstar FL (Gambar 1).
Gambar 2．Bright Field lan Gambar Fluoresensi saka PBMC
2. Konsentrasi lan Viabilitas PBMC
Sampel PBMC diencerake kaping 2, 4, 8 lan 16 karo PBS, banjur conto kasebut diinkubasi nganggo campuran pewarna AO / PI lan dianalisis kanthi Countstar FL.Asil konsentrasi lan viabilitas PBMC dituduhake kaya ing ngisor iki:
