Sel mononuklear darah periferal (PBMC) sering diproses untuk memisahkan daripada darah keseluruhan melalui sentrifugasi kecerunan ketumpatan.Sel-sel tersebut terdiri daripada limfosit (sel T, sel B, sel NK) dan monosit, yang biasa digunakan dalam bidang imunologi, terapi sel, penyakit berjangkit dan pembangunan vaksin.Memantau dan menganalisis daya maju dan kepekatan PBMC adalah penting untuk makmal klinikal, penyelidikan sains perubatan asas dan pengeluaran sel imun.
Rajah 1. PBMC diasingkan daripada darah segar dengan sentrifugasi kecerunan Ketumpatan
Pengiraan Dwi-pendarfluor AOPI ialah jenis ujian yang digunakan untuk mengesan kepekatan dan daya maju sel.Penyelesaiannya ialah gabungan oren acridine (noda asid nukleik pendarfluor hijau) dan propidium iodida (noda asid nukleik pendarfluor merah).Propidium iodide (PI) ialah pewarna pengecualian membran yang hanya memasuki sel dengan membran yang terjejas, manakala oren acridine mampu menembusi semua sel dalam populasi.Apabila kedua-dua pewarna terdapat dalam nukleus, propidium iodide menyebabkan pengurangan dalam pendarfluor oren acridine oleh pemindahan tenaga resonans pendarfluor (FRET).Akibatnya, sel bernukleus dengan membran utuh mengotorkan hijau pendarfluor dan dikira sebagai hidup, manakala sel bernukleus dengan membran terjejas hanya mengotorkan merah pendarfluor dan dikira sebagai mati apabila menggunakan sistem Countstar® FL.Bahan bukan nukleus seperti sel darah merah, platelet dan serpihan tidak berpendar dan diabaikan oleh perisian Countstar® FL.
Prosedur Eksperimen:
1. Cairkan sampel PBMC kepada 5 kepekatan berbeza dengan PBS;
2. Tambahkan 12µl larutan AO/PI ke dalam sampel 12µl, dicampur perlahan-lahan dengan pipet;
3. Lukiskan campuran 20µl ke dalam slaid ruang;
4. Benarkan sel-sel untuk menetap di dalam ruang selama kira-kira 1 minit;
5. Serangga slaid ke dalam instrumen Countstar FL;
6. Pilih ujian "AO/PI Viability", kemudian uji oleh Countstar FL.
Awas: AO dan PI adalah karsinogen yang berpotensi.Pengendali disyorkan memakai peralatan pelindung diri (PPE) untuk mengelakkan sentuhan terus dengan kulit dan mata.
Keputusan:
1.Imej Bidang Terang dan Pendarfluor PBMC
Pewarna AO dan PI adalah pewarna DNA dalam nukleus sel sel.Oleh itu, Platelet, sel darah merah atau serpihan selular tidak dapat menjejaskan kepekatan dan hasil daya maju PBMC.Sel hidup, sel mati dan serpihan boleh dibezakan dengan mudah berdasarkan imej yang dihasilkan oleh Countstar FL (Rajah 1).
Rajah 2．Imej Bidang Terang dan Pendarfluor PBMC
2.Tumpuan dan Daya Maju PBMC
Sampel PBMC telah dicairkan dalam 2, 4, 8 dan 16 kali dengan PBS, kemudian sampel tersebut diinkubasi dengan campuran pewarna AO/PI dan masing-masing dianalisis oleh Countstar FL.Keputusan kepekatan dan daya maju PBMC ditunjukkan seperti rajah di bawah:
