Perifere bloed mononukleêre selle (PBMC's) word dikwels verwerk om van volbloed te skei deur digtheidsgradiëntsentrifugering.Daardie selle bestaan uit limfosiete (T-selle, B-selle, NK-selle) en monosiete, wat algemeen gebruik word op die gebied van immunologie, selterapie, aansteeklike siektes en entstofontwikkeling.Monitering en ontleding van lewensvatbaarheid en konsentrasie van PBMC is van kardinale belang vir die kliniese laboratoriums, basiese mediese wetenskaplike navorsing en immuunselproduksie.
Fig 1. Geïsoleerde PBMC uit vars bloed met digtheidsgradiënt sentrifugering
AOPI Dual-fluoresces telling is die toetstipe wat gebruik word vir die opsporing van selkonsentrasie en lewensvatbaarheid.Die oplossing is 'n kombinasie van akridien oranje (die groen-fluoresserende nukleïensuur vlek) en propidium jodied (die rooi-fluoresserende nukleïensuur vlek).Propidiumjodied (PI) is 'n membraanuitsluitingskleurstof wat slegs selle met gekompromitteerde membrane binnedring, terwyl akridienoranje in staat is om alle selle in 'n populasie binne te dring.Wanneer beide kleurstowwe in die kern teenwoordig is, veroorsaak propidiumjodied 'n vermindering in akridien oranje fluoressensie deur fluoressensie resonansie energie-oordrag (FRET).Gevolglik vlek kernselle met ongeskonde membrane fluoresserend groen en word as lewendig getel, terwyl kernselle met gekompromitteerde membrane slegs fluoresserend rooi kleur en as dood getel word wanneer die Countstar® FL-stelsel gebruik word.Nie-kernvormige materiaal soos rooibloedselle, bloedplaatjies en puin fluoresseer nie en word deur die Countstar® FL-sagteware geïgnoreer.
Eksperimentele prosedure:
1.Verdun die PBMC-monster in 5 verskillende konsentrasies met PBS;
2. Voeg 12µl AO/PI-oplossing by 12µl monster, liggies gemeng met pipet;
3. Trek 20µl mengsel in kamerskyfie;
4. Laat die selle vir ongeveer 1 minuut in die kamer sit;
5.Insekteer die skyfie in Countstar FL-instrument;
6. Kies die "AO/PI Viability"-toets, toets dan deur Countstar FL.
Let op: AO en PI is 'n potensiële karsinogeen.Dit word aanbeveel dat die operateur persoonlike beskermende toerusting (PPE) dra om direkte kontak met die vel en oë te vermy.
Resultaat:
1.Bright Field en Fluorescence beelde van die PBMC
Die AO- en PI-kleurstof is albei vlekke DNA in die selkern van selle.Daarom kan bloedplaatjies, rooibloedselle of sellulêre puin nie PBMC's konsentrasie en lewensvatbaarheidsresultaat beïnvloed nie.Lewende selle, dooie selle en puin kan maklik onderskei word op grond van die beelde wat deur Countstar FL gegenereer word (Figuur 1).
Figuur 2. Helderveld- en fluoressensiebeelde van die PBMC
2.Konsentrasie en lewensvatbaarheid van PBMC
Die PBMC-monsters is 2, 4, 8 en 16 keer verdun met PBS, dan is daardie monsters met 'n AO/PI-kleurstofmengsel geïnkubeer en deur Countstar FL onderskeidelik ontleed.Die resultaat van konsentrasie en lewensvatbaarheid van PBMC word soos hieronder getoon:
