ਪੈਰੀਫਿਰਲ ਬਲੱਡ ਮੋਨੋਨਿਊਕਲੀਅਰ ਸੈੱਲਾਂ (PBMCs) ਨੂੰ ਅਕਸਰ ਘਣਤਾ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਪੂਰੇ ਖੂਨ ਤੋਂ ਵੱਖ ਕਰਨ ਲਈ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਉਹ ਸੈੱਲ ਲਿਮਫੋਸਾਈਟਸ (ਟੀ ਸੈੱਲ, ਬੀ ਸੈੱਲ, ਐਨ ਕੇ ਸੈੱਲ) ਅਤੇ ਮੋਨੋਸਾਈਟਸ ਦੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇਮਯੂਨੋਲੋਜੀ, ਸੈੱਲ ਥੈਰੇਪੀ, ਛੂਤ ਦੀਆਂ ਬਿਮਾਰੀਆਂ ਅਤੇ ਟੀਕੇ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਦੇ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਕਲੀਨਿਕਲ ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾਵਾਂ, ਮੁਢਲੇ ਮੈਡੀਕਲ ਵਿਗਿਆਨ ਖੋਜ ਅਤੇ ਇਮਿਊਨ ਸੈੱਲ ਉਤਪਾਦਨ ਲਈ PBMC ਦੀ ਵਿਹਾਰਕਤਾ ਅਤੇ ਇਕਾਗਰਤਾ ਦੀ ਨਿਗਰਾਨੀ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨਾ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ।
ਚਿੱਤਰ 1. ਘਣਤਾ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਸੈਂਟਰੀਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੇ ਨਾਲ ਤਾਜ਼ੇ ਖੂਨ ਤੋਂ ਪੀਬੀਐਮਸੀ ਨੂੰ ਅਲੱਗ ਕੀਤਾ ਗਿਆ
ਏਓਪੀਆਈ ਡੁਅਲ-ਫਲੋਰੋਸੇਸ ਕਾਉਂਟਿੰਗ ਸੈੱਲ ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਅਤੇ ਵਿਹਾਰਕਤਾ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਪਰਖ ਦੀ ਕਿਸਮ ਹੈ।ਹੱਲ ਐਕ੍ਰਿਡਾਈਨ ਸੰਤਰੀ (ਹਰੇ-ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਨਿਊਕਲੀਇਕ ਐਸਿਡ ਦਾਗ) ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਪੀਡੀਅਮ ਆਇਓਡਾਈਡ (ਲਾਲ-ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਦਾਗ) ਦਾ ਸੁਮੇਲ ਹੈ।ਪ੍ਰੋਪੀਡੀਅਮ ਆਇਓਡਾਈਡ (PI) ਇੱਕ ਝਿੱਲੀ ਦੀ ਬੇਦਖਲੀ ਰੰਗਤ ਹੈ ਜੋ ਸਿਰਫ ਕਮਜ਼ੋਰ ਝਿੱਲੀ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਦਾਖਲ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਐਕਰੀਡਾਈਨ ਸੰਤਰੀ ਆਬਾਦੀ ਵਿੱਚ ਸਾਰੇ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਵੇਸ਼ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਜਦੋਂ ਦੋਵੇਂ ਰੰਗ ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਤਾਂ ਪ੍ਰੋਪੀਡੀਅਮ ਆਇਓਡਾਈਡ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਰੈਜ਼ੋਨੈਂਸ ਐਨਰਜੀ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ (FRET) ਦੁਆਰਾ ਐਕਰੀਡਾਈਨ ਔਰੇਂਜ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਵਿੱਚ ਕਮੀ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣਦਾ ਹੈ।ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ, ਬਰਕਰਾਰ ਝਿੱਲੀ ਵਾਲੇ ਨਿਊਕਲੀਏਟਿਡ ਸੈੱਲ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਹਰੇ ਰੰਗ ਦੇ ਦਾਗ ਬਣਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਲਾਈਵ ਵਜੋਂ ਗਿਣੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਸਮਝੌਤਾ ਕੀਤੀ ਝਿੱਲੀ ਵਾਲੇ ਨਿਊਕਲੀਏਟਿਡ ਸੈੱਲ ਸਿਰਫ਼ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਲਾਲ ਰੰਗ ਦੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਕਾਊਂਟਸਟਾਰ® FL ਸਿਸਟਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ ਮਰੇ ਹੋਏ ਗਿਣੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਗੈਰ-ਨਿਊਕਲੀਏਟਿਡ ਸਮੱਗਰੀ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਲਾਲ ਰਕਤਾਣੂਆਂ, ਪਲੇਟਲੈਟਸ ਅਤੇ ਮਲਬੇ ਫਲੋਰਸ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਕਾਉਂਟਸਟਾਰ® FL ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਦੁਆਰਾ ਅਣਡਿੱਠ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।
ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ:
1. PBMC ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ PBS ਨਾਲ 5 ਵੱਖ-ਵੱਖ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਵਿੱਚ ਪਤਲਾ ਕਰੋ;
2. 12µl AO/PI ਘੋਲ ਨੂੰ 12µl ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰੋ, ਪਾਈਪੇਟ ਨਾਲ ਨਰਮੀ ਨਾਲ ਮਿਲਾਓ;
3. ਚੈਂਬਰ ਸਲਾਈਡ ਵਿੱਚ 20µl ਮਿਸ਼ਰਣ ਖਿੱਚੋ;
4. ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਲਗਭਗ 1 ਮਿੰਟ ਲਈ ਚੈਂਬਰ ਵਿੱਚ ਸੈਟਲ ਹੋਣ ਦਿਓ;
5. ਕਾਊਂਟਸਟਾਰ FL ਯੰਤਰ ਵਿੱਚ ਸਲਾਈਡ ਨੂੰ ਕੀਟ ਕਰੋ;
6. “AO/PI ਵਿਹਾਰਕਤਾ” ਪਰਖ ਚੁਣੋ, ਫਿਰ ਕਾਊਂਟਸਟਾਰ FL ਦੁਆਰਾ ਟੈਸਟ ਕਰੋ।
ਸਾਵਧਾਨ: AO ਅਤੇ PI ਇੱਕ ਸੰਭਾਵੀ ਕਾਰਸੀਨੋਜਨ ਹੈ।ਇਹ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਕਿ ਆਪਰੇਟਰ ਚਮੜੀ ਅਤੇ ਅੱਖਾਂ ਦੇ ਸਿੱਧੇ ਸੰਪਰਕ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ ਨਿੱਜੀ ਸੁਰੱਖਿਆ ਉਪਕਰਣ (PPE) ਪਹਿਨੇ।
ਨਤੀਜਾ:
1. PBMC ਦੇ ਬ੍ਰਾਈਟ ਫੀਲਡ ਅਤੇ ਫਲੋਰਸੈਂਸ ਚਿੱਤਰ
AO ਅਤੇ PI ਡਾਈ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਸੈੱਲ ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਵਿੱਚ ਦੋਵੇਂ ਧੱਬੇ ਡੀਐਨਏ ਹਨ।ਇਸ ਲਈ, ਪਲੇਟਲੈਟਸ, ਲਾਲ ਖੂਨ ਦੇ ਸੈੱਲ, ਜਾਂ ਸੈਲੂਲਰ ਮਲਬੇ PBMCs ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਅਤੇ ਵਿਹਾਰਕਤਾ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਅਸਮਰੱਥ ਹਨ।ਕਾਊਂਟਸਟਾਰ FL (ਚਿੱਤਰ 1) ਦੁਆਰਾ ਬਣਾਏ ਗਏ ਚਿੱਤਰਾਂ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ ਜੀਵਿਤ ਸੈੱਲ, ਮਰੇ ਹੋਏ ਸੈੱਲ ਅਤੇ ਮਲਬੇ ਨੂੰ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਪਛਾਣਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਚਿੱਤਰ 2. PBMC ਦੇ ਚਮਕਦਾਰ ਖੇਤਰ ਅਤੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਚਿੱਤਰ
2. PBMC ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਅਤੇ ਵਿਹਾਰਕਤਾ
PBMC ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ PBS ਨਾਲ 2, 4, 8 ਅਤੇ 16 ਵਾਰ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਫਿਰ ਉਹਨਾਂ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ AO/PI ਡਾਈ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨਾਲ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਕਾਉਂਟਸਟਾਰ FL ਦੁਆਰਾ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।PBMC ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਅਤੇ ਵਿਹਾਰਕਤਾ ਦਾ ਨਤੀਜਾ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਚਿੱਤਰ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ:
