سلول های تک هسته ای خون محیطی (PBMCs) اغلب برای جداسازی از خون کامل توسط سانتریفیوژ گرادیان چگالی پردازش می شوند.این سلول ها از لنفوسیت ها (سلول های T، سلول های B، سلول های NK) و مونوسیت ها تشکیل شده اند که معمولاً در زمینه ایمونولوژی، سلول درمانی، بیماری های عفونی و توسعه واکسن استفاده می شوند.نظارت و تجزیه و تحلیل زنده ماندن و غلظت PBMC برای آزمایشگاه‌های بالینی، تحقیقات علوم پزشکی پایه و تولید سلول‌های ایمنی ضروری است.
شکل 1. PBMC جدا شده از خون تازه با سانتریفیوژ با گرادیان چگالی
AOPI Dual-fluoresces counting نوع سنجشی است که برای تشخیص غلظت و زنده ماندن سلول استفاده می شود.محلول ترکیبی از آکریدین نارنجی (رنگ اسید نوکلئیک فلورسنت سبز) و یدید پروپیدیوم (رنگ اسید نوکلئیک فلورسنت قرمز) است.پروپیدیوم یدید (PI) یک رنگ حذف غشایی است که فقط وارد سلول‌هایی می‌شود که غشاهای آسیب‌دیده دارند، در حالی که آکریدین نارنجی قادر است به تمام سلول‌های یک جمعیت نفوذ کند.هنگامی که هر دو رنگ در هسته وجود دارند، یدید پروپیدیوم باعث کاهش فلورسانس نارنجی آکریدین با انتقال انرژی رزونانس فلورسانس (FRET) می شود.در نتیجه، سلول‌های هسته‌دار با غشای سالم رنگ سبز فلورسنت دارند و به‌عنوان زنده شمرده می‌شوند، در حالی که سلول‌های هسته‌دار با غشاهای آسیب‌دیده فقط قرمز فلورسنت را رنگ می‌کنند و هنگام استفاده از سیستم Countstar® FL مرده محسوب می‌شوند.مواد غیر هسته ای مانند گلبول های قرمز، پلاکت ها و باقی مانده ها فلورسانس نمی کنند و توسط نرم افزار Countstar® FL نادیده گرفته می شوند.
روش آزمایشی:
1. نمونه PBMC را به 5 غلظت مختلف با PBS رقیق کنید.
2. 12 میکرولیتر محلول AO/PI را به نمونه 12 میکرولیتری اضافه کنید، به آرامی با پیپت مخلوط کنید.
3. 20 میکرولیتر مخلوط را داخل اسلاید محفظه بکشید.
4. اجازه دهید سلول ها به مدت حدود 1 دقیقه در محفظه مستقر شوند.
5. اسلاید را در ابزار Countstar FL حشره دهید.
6. سنجش "AO/PI Viability" را انتخاب کنید، سپس توسط Countstar FL تست کنید.
احتیاط: AO و PI یک سرطان زا بالقوه است.توصیه می شود که اپراتور از تجهیزات حفاظت فردی (PPE) استفاده کند تا از تماس مستقیم با پوست و چشم جلوگیری شود.
نتیجه:
1. میدان روشن و تصاویر فلورسانس PBMC
رنگ‌های AO و PI هر دو رنگ‌آمیزی DNA در هسته سلولی هستند.بنابراین، پلاکت‌ها، گلبول‌های قرمز یا بقایای سلولی نمی‌توانند بر غلظت PBMC و نتیجه زنده‌مانی تأثیر بگذارند.بر اساس تصاویر تولید شده توسط Countstar FL (شکل 1) می توان سلول های زنده، سلول های مرده و باقی مانده ها را به راحتی تشخیص داد.
شکل 2. تصاویر میدان روشن و فلورسانس PBMC
2. تمرکز و دوام PBMC
نمونه های PBMC در 2، 4، 8 و 16 بار با PBS رقیق شدند، سپس آن نمونه ها با مخلوط رنگ AO/PI انکوبه شدند و به ترتیب توسط Countstar FL آنالیز شدند.نتیجه غلظت و زنده ماندن PBMC به شکل زیر نشان داده شده است:
