កោសិកា mononuclear ឈាមគ្រឿងកុំព្យូទ័រ (PBMCs) ជារឿយៗត្រូវបានដំណើរការដើម្បីបំបែកចេញពីឈាមទាំងមូលដោយការ centrifugation ជម្រាលដង់ស៊ីតេ។កោសិកាទាំងនោះមានកោសិកា lymphocytes (កោសិកា T កោសិកា B កោសិកា NK) និង monocytes ដែលត្រូវបានប្រើជាទូទៅក្នុងវិស័យភាពស៊ាំ ការព្យាបាលដោយកោសិកា ជំងឺឆ្លង និងការអភិវឌ្ឍន៍វ៉ាក់សាំង។ការត្រួតពិនិត្យ និងវិភាគលទ្ធភាពជោគជ័យ និងការប្រមូលផ្តុំនៃ PBMC គឺមានសារៈសំខាន់សម្រាប់មន្ទីរពិសោធន៍គ្លីនិក ការស្រាវជ្រាវវិទ្យាសាស្ត្រវេជ្ជសាស្ត្រជាមូលដ្ឋាន និងការផលិតកោសិកាភាពស៊ាំ។
រូបទី 1. PBMC ដាច់ដោយឡែកពីឈាមស្រស់ជាមួយនឹងការ centrifugation ជម្រាលដង់ស៊ីតេ
ការរាប់ AOPI Dual-fluoresces គឺជាប្រភេទតេស្តដែលប្រើសម្រាប់រកមើលកំហាប់កោសិកា និងលទ្ធភាពជោគជ័យ។ដំណោះស្រាយគឺការរួមបញ្ចូលគ្នានៃពណ៌ទឹកក្រូច acridine (ស្នាមប្រឡាក់អាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកពណ៌បៃតង - ហ្វ្លុយអូរីស) និងប្រូភីដ្យូមអ៊ីយ៉ូត (ស្នាមប្រឡាក់អាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកក្រហម - ហ្វ្លុយអូរីស) ។Propidium iodide (PI) គឺជាថ្នាំជ្រលក់ដែលមិនរាប់បញ្ចូលភ្នាសដែលចូលទៅក្នុងកោសិកាដែលមានភ្នាសសម្របសម្រួល ខណៈពេលដែលពណ៌ទឹកក្រូច acridine អាចជ្រាបចូលទៅក្នុងកោសិកាទាំងអស់ក្នុងចំនួនប្រជាជនមួយ។នៅពេលដែលថ្នាំជ្រលក់ទាំងពីរមានវត្តមាននៅក្នុងស្នូល ប្រូភីដ្យូម អ៊ីយ៉ូត បណ្តាលឱ្យមានការថយចុះនៃហ្វ្លុយអូរីពណ៌ទឹកក្រូចអាគ្រីឌីន ដោយការផ្ទេរថាមពល ហ្វ្រូរ៉េសសេនស័រ (FRET)។ជាលទ្ធផល កោសិកា nucleated ដែលមានភ្នាសនៅដដែលមានស្នាមប្រឡាក់ពណ៌បៃតង ហើយត្រូវបានរាប់ថាមានជីវិត ចំណែកឯកោសិកា nucleated ដែលមានភ្នាសសម្របសម្រួលមានតែស្នាមប្រឡាក់ fluorescent ក្រហម ហើយត្រូវបានរាប់ថាស្លាប់នៅពេលប្រើប្រព័ន្ធCountstar® FL។វត្ថុធាតុដែលមិនមានសារធាតុ nucleated ដូចជាកោសិកាឈាមក្រហម ប្លាកែត និងកំទេចកំទីមិនមានពន្លឺទេ ហើយត្រូវបានមិនអើពើដោយកម្មវិធីCountstar® FL ។
ដំណើរការពិសោធន៍៖
1.Dilute គំរូ PBMC ទៅជា 5 កំហាប់ផ្សេងគ្នាជាមួយ PBS;
2. បន្ថែមដំណោះស្រាយ 12µl AO/PI ទៅក្នុងគំរូ 12µl លាយថ្នមៗជាមួយ pipette;
3. គូរល្បាយ 20µl ចូលទៅក្នុងស្លាយបន្ទប់;
4. អនុញ្ញាតឱ្យកោសិកាតាំងទីលំនៅក្នុងបន្ទប់ប្រហែល 1 នាទី;
5.Insect ស្លាយចូលទៅក្នុងឧបករណ៍ Countstar FL;
6. ជ្រើសរើសការវាយតម្លៃ "AO/PI Viability" បន្ទាប់មកសាកល្បងដោយ Countstar FL ។
ប្រយ័ត្ន៖ AO និង PI គឺជាសារធាតុបង្កមហារីក។វាត្រូវបានណែនាំឱ្យប្រតិបត្តិករពាក់ឧបករណ៍ការពារផ្ទាល់ខ្លួន (PPE) ដើម្បីជៀសវាងការប៉ះពាល់ដោយផ្ទាល់ជាមួយស្បែក និងភ្នែក។
លទ្ធផល៖
រូបភាព 1.Bright Field និង Fluorescence នៃ PBMC
ថ្នាំជ្រលក់ AO និង PI គឺជាស្នាមប្រឡាក់ DNA ទាំងពីរនៅក្នុងស្នូលកោសិកានៃកោសិកា។ដូច្នេះ ប្លាកែត កោសិកាឈាមក្រហម ឬកំទេចកំទីកោសិកា មិនអាចប៉ះពាល់ដល់ការប្រមូលផ្តុំ PBMCs និងលទ្ធផលលទ្ធភាពជោគជ័យបានទេ។កោសិការស់ កោសិកាងាប់ និងកំទេចកំទីអាចសម្គាល់បានយ៉ាងងាយស្រួលដោយផ្អែកលើរូបភាពដែលបង្កើតដោយ Countstar FL (រូបភាពទី 1)។
រូបភាពទី 2. រូបភាពវាលភ្លឺ និងពន្លឺនៃ PBMC
2. ការប្រមូលផ្តុំ និងលទ្ធភាពជោគជ័យនៃ PBMC
សំណាក PBMC ត្រូវបានពនឺក្នុង 2, 4, 8 និង 16 ដងជាមួយ PBS បន្ទាប់មកសំណាកទាំងនោះត្រូវបាន incubated ជាមួយល្បាយ AO/PI dye និងវិភាគដោយ Countstar FL រៀងគ្នា។លទ្ធផលនៃការប្រមូលផ្តុំ និងលទ្ធភាពជោគជ័យនៃ PBMC ត្រូវបានបង្ហាញដូចខាងក្រោម៖
