പെരിഫറൽ ബ്ലഡ് മോണോ ന്യൂക്ലിയർ സെല്ലുകൾ (പിബിഎംസി) ഡെൻസിറ്റി ഗ്രേഡിയന്റ് സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി മുഴുവൻ രക്തത്തിൽ നിന്നും വേർപെടുത്താൻ പലപ്പോഴും പ്രോസസ്സ് ചെയ്യപ്പെടുന്നു.ആ കോശങ്ങളിൽ ലിംഫോസൈറ്റുകൾ (ടി സെല്ലുകൾ, ബി സെല്ലുകൾ, എൻകെ സെല്ലുകൾ), മോണോസൈറ്റുകൾ എന്നിവ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, സാധാരണയായി രോഗപ്രതിരോധം, സെൽ തെറാപ്പി, പകർച്ചവ്യാധികൾ, വാക്സിൻ വികസനം എന്നിവയിൽ ഉപയോഗിക്കുന്നു.ക്ലിനിക്കൽ ലബോറട്ടറികൾ, അടിസ്ഥാന മെഡിക്കൽ സയൻസ് ഗവേഷണം, രോഗപ്രതിരോധ കോശ ഉത്പാദനം എന്നിവയ്ക്ക് പിബിഎംസിയുടെ പ്രവർത്തനക്ഷമതയും ഏകാഗ്രതയും നിരീക്ഷിക്കുന്നതും വിശകലനം ചെയ്യുന്നതും നിർണായകമാണ്.
ചിത്രം 1. സാന്ദ്രത ഗ്രേഡിയന്റ് സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷനോടുകൂടിയ പുതിയ രക്തത്തിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത പിബിഎംസി
AOPI ഡ്യുവൽ ഫ്ലൂറസസ് കൗണ്ടിംഗ് എന്നത് സെൽ കോൺസൺട്രേഷനും പ്രവർത്തനക്ഷമതയും കണ്ടുപിടിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന ഒരു അസ്സേ തരം ആണ്.അക്രിഡൈൻ ഓറഞ്ച് (പച്ച-ഫ്ലൂറസെന്റ് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് സ്റ്റെയിൻ), പ്രൊപിഡിയം അയഡൈഡ് (ചുവപ്പ്-ഫ്ലൂറസെന്റ് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് സ്റ്റെയിൻ) എന്നിവയുടെ സംയോജനമാണ് പരിഹാരം.പ്രോപ്പിഡിയം അയഡൈഡ് (PI) ഒരു മെംബ്രൻ ഒഴിവാക്കൽ ചായമാണ്, അത് വിട്ടുവീഴ്ച ചെയ്ത ചർമ്മങ്ങളുള്ള കോശങ്ങളിലേക്ക് മാത്രം പ്രവേശിക്കുന്നു, അതേസമയം അക്രിഡിൻ ഓറഞ്ചിന് ഒരു ജനസംഖ്യയിലെ എല്ലാ കോശങ്ങളിലും തുളച്ചുകയറാൻ കഴിയും.രണ്ട് ചായങ്ങളും ന്യൂക്ലിയസിൽ ഉള്ളപ്പോൾ, ഫ്ലൂറസെൻസ് റിസോണൻസ് എനർജി ട്രാൻസ്ഫർ (FRET) വഴി പ്രൊപിഡിയം അയോഡൈഡ് അക്രിഡൈൻ ഓറഞ്ച് ഫ്ലൂറസെൻസ് കുറയ്ക്കുന്നു.തൽഫലമായി, കേടുപാടുകൾ സംഭവിക്കാത്ത മെംബ്രണുകളുള്ള ന്യൂക്ലിയേറ്റഡ് സെല്ലുകൾ ഫ്ലൂറസെന്റ് പച്ച നിറം നൽകുകയും ലൈവായി കണക്കാക്കുകയും ചെയ്യുന്നു, അതേസമയം വിട്ടുവീഴ്ച ചെയ്ത ചർമ്മങ്ങളുള്ള ന്യൂക്ലിയേറ്റഡ് സെല്ലുകൾ ഫ്ലൂറസെന്റ് ചുവപ്പ് മാത്രം പാടുകയും Countstar® FL സിസ്റ്റം ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ മരിച്ചതായി കണക്കാക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.ചുവന്ന രക്താണുക്കൾ, പ്ലേറ്റ്‌ലെറ്റുകൾ, അവശിഷ്ടങ്ങൾ എന്നിവ പോലുള്ള ന്യൂക്ലിയേറ്റഡ് അല്ലാത്ത വസ്തുക്കൾ ഫ്ലൂറസ് ചെയ്യുന്നില്ല, അവ Countstar® FL സോഫ്റ്റ്‌വെയർ അവഗണിക്കുന്നു.
പരീക്ഷണാത്മക നടപടിക്രമം:
1. PBMC സാമ്പിൾ PBS ഉപയോഗിച്ച് 5 വ്യത്യസ്ത സാന്ദ്രതകളിലേക്ക് നേർപ്പിക്കുക;
2.12µl സാമ്പിളിലേക്ക് 12µl AO/PI ലായനി ചേർക്കുക, പതുക്കെ പൈപ്പറ്റുമായി കലർത്തി;
3. ചേമ്പർ സ്ലൈഡിലേക്ക് 20µl മിശ്രിതം വരയ്ക്കുക;
4.സെല്ലുകളെ ഏകദേശം 1 മിനിറ്റ് അറയിൽ സ്ഥിരതാമസമാക്കാൻ അനുവദിക്കുക;
5. Countstar FL ഉപകരണത്തിലേക്ക് സ്ലൈഡ് കീടിപ്പിക്കുക;
6. “AO/PI വയബിലിറ്റി” അസ്സേ തിരഞ്ഞെടുക്കുക, തുടർന്ന് Countstar FL പരീക്ഷിക്കുക.
മുൻകരുതൽ: AO, PI എന്നിവ ക്യാൻസറിന് സാധ്യതയുള്ളതാണ്.ചർമ്മവുമായും കണ്ണുകളുമായും നേരിട്ടുള്ള സമ്പർക്കം ഒഴിവാക്കാൻ ഓപ്പറേറ്റർ വ്യക്തിഗത സംരക്ഷണ ഉപകരണങ്ങൾ (പിപിഇ) ധരിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.
ഫലമായി:
1.പിബിഎംസിയുടെ ബ്രൈറ്റ് ഫീൽഡും ഫ്ലൂറസെൻസ് ചിത്രങ്ങളും
AO, PI ഡൈ എന്നിവ കോശങ്ങളുടെ സെൽ ന്യൂക്ലിയസിലെ സ്റ്റെയിൻ ഡിഎൻഎയാണ്.അതിനാൽ, പ്ലേറ്റ്‌ലെറ്റുകൾക്കോ ചുവന്ന രക്താണുക്കൾക്കോ സെല്ലുലാർ അവശിഷ്ടങ്ങൾക്കോ പിബിഎംസിയുടെ ഏകാഗ്രതയെയും പ്രവർത്തന ഫലത്തെയും ബാധിക്കാൻ കഴിയില്ല.Countstar FL സൃഷ്ടിച്ച ചിത്രങ്ങളെ അടിസ്ഥാനമാക്കി ജീവനുള്ള കോശങ്ങൾ, മൃതകോശങ്ങൾ, അവശിഷ്ടങ്ങൾ എന്നിവ എളുപ്പത്തിൽ വേർതിരിച്ചറിയാൻ കഴിയും (ചിത്രം 1).
ചിത്രം 2.പിബിഎംസിയുടെ ബ്രൈറ്റ് ഫീൽഡും ഫ്ലൂറസെൻസ് ചിത്രങ്ങളും
2.പിബിഎംസിയുടെ ഏകാഗ്രതയും പ്രവർത്തനക്ഷമതയും
PBMC സാമ്പിളുകൾ PBS ഉപയോഗിച്ച് 2, 4, 8, 16 തവണ ലയിപ്പിച്ചു, തുടർന്ന് ആ സാമ്പിളുകൾ AO/PI ഡൈ മിശ്രിതം ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും Countstar FL യഥാക്രമം വിശകലനം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.PBMC യുടെ ഏകാഗ്രതയുടെയും പ്രവർത്തനക്ഷമതയുടെയും ഫലം ചുവടെയുള്ള ചിത്രം കാണിച്ചിരിക്കുന്നു:
