Perifeare bloed mononukleêre sellen (PBMC's) wurde faak ferwurke om te skieden fan folslein bloed troch tichtensgradientsintrifugaasje.Dy sellen binne besteande út lymphocytes (T sellen, B sellen, NK sellen) en monocytes, ornaris brûkt op it mêd fan immunology, sel terapy, besmetlike sykten en faksin ûntwikkeling.It kontrolearjen en analysearjen fan leefberens en konsintraasje fan PBMC is krúsjaal foar de klinyske laboratoaria, basisûndersyk fan medyske wittenskip en ymmúnzellproduksje.
Fig 1. Isolearre PBMC út farsk bloed mei Density gradient centrifugation
AOPI Dual-fluoresces tellen is it assaytype dat wurdt brûkt foar it opspoaren fan selkonsintraasje en leefberens.De oplossing is in kombinaasje fan acridine oranje (de grien-fluorescent nucleic acid stain) en propidium iodide (de read-fluorescent nucleic acid stain).Propidium iodide (PI) is in membraan útsluting kleurstof dy't allinnich komt yn sellen mei kompromittearre membranen, wylst acridine oranje is by steat om te penetrearje alle sellen yn in befolking.As beide kleurstoffen oanwêzich binne yn 'e kearn, feroarsake propidiumjodide in reduksje yn acridine oranje fluorescence troch fluorescence resonance energy transfer (FRET).As gefolch, nucleated sellen mei yntakt membranen kleurje fluorescent grien en wurde rekkene as live, wylst nucleated sellen mei kompromittearre membranen allinnich kleurje fluorescent read en wurde teld as dea by it brûken fan it Countstar® FL systeem.Non-nucleated materiaal lykas reade bloedsellen, bloedplaatjes en pún fluorescearje net en wurde negearre troch de Countstar® FL-software.
Eksperimintele proseduere:
1.Dilute de PBMC sample yn 5 ferskillende konsintraasjes mei PBS;
2.Add 12µl AO / PI oplossing yn 12µl sample, sêft mingd mei pipette;
3.Draw 20µl mingsel yn keamer slide;
4.Low de sellen om yn 'e keamer te setten foar sawat 1 minút;
5.Insect de slide yn Countstar FL ynstrumint;
6.Kies de "AO / PI Viability" assay, dan test troch Countstar FL.
Foarsichtich: AO en PI binne in potinsjele karzinogen.It wurdt oanrikkemandearre dat de operator persoanlike beskermjende apparatuer (PPE) draacht om direkt kontakt mei hûd en eagen te foarkommen.
Resultaat:
1.Bright Field en Fluorescence bylden fan de PBMC
De AO- en PI-ferve binne beide flekken DNA yn 'e selkearn fan sellen.Dêrom binne bloedplaatjes, reade bloedsellen, as sellulêre ôffal net yn steat om PBMC's konsintraasje en leefberensresultaat te beynfloedzjen.Libjende sellen, deade sellen en pún kinne maklik te ûnderskieden wurde op basis fan 'e ôfbyldings generearre troch Countstar FL (figuer 1).
Ofbylding 2. Bright Field and Fluorescence ôfbyldings fan 'e PBMC
2.Konsintraasje en leefberens fan PBMC
De PBMC-monsters waarden yn 2, 4, 8 en 16 kear verdund mei PBS, dan waarden dy samples ynkubeare mei in AO / PI-fervegemerming en respektivelik analysearre troch Countstar FL.It resultaat fan konsintraasje en leefberens fan PBMC wurdt werjûn as hjirûnder figuer:
