غالبًا ما تتم معالجة الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) لفصل الدم الكامل عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة.تتكون هذه الخلايا من الخلايا الليمفاوية (الخلايا التائية ، والخلايا البائية ، والخلايا القاتلة الطبيعية) والخلايا الوحيدة المستخدمة في مجال المناعة ، والعلاج الخلوي ، والأمراض المعدية وتطوير اللقاح.تعد مراقبة وتحليل جدوى وتركيز PBMC أمرًا بالغ الأهمية للمختبرات السريرية وأبحاث العلوم الطبية الأساسية وإنتاج الخلايا المناعية.
الشكل 1. عزل PBMC من الدم الطازج مع الطرد المركزي المتدرج الكثافة
يعد عد AOPI Dual-fluoresces نوع الفحص المستخدم للكشف عن تركيز الخلية وقابليتها للحياة.المحلول عبارة عن مزيج من أكريدين البرتقالي (وصمة عار الحمض النووي الفلوري الأخضر) ويوديد البروبيديوم (بقعة الحمض النووي الفلورية الحمراء).يوديد البروبيديوم (PI) هو صبغة استبعاد غشاء لا تدخل إلا إلى الخلايا ذات الأغشية المعرضة للخطر ، في حين أن أكريدين البرتقالي قادر على اختراق جميع الخلايا في المجتمع.عند وجود كلتا الأصباغ في النواة ، يتسبب يوديد البروبيديوم في انخفاض التألق البرتقالي أكريدين عن طريق نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET).نتيجة لذلك ، تلطخ الخلايا ذات الأنوية ذات الأغشية السليمة باللون الأخضر الفلوري وتُحسب على أنها حية ، في حين أن الخلايا ذات النواة ذات الأغشية المخترقة تلطخ اللون الأحمر الفلوري فقط ويتم حسابها على أنها ميتة عند استخدام نظام ® FL.المواد غير المنواة مثل خلايا الدم الحمراء والصفائح الدموية والحطام لا تتألق ويتم تجاهلها بواسطة برنامج ® FL.
طريقة تجريبية:
1. تمييع عينة PBMC إلى 5 تركيزات مختلفة مع PBS ؛
2-إضافة 12 مايكرولتر من محلول AO / PI إلى عينة 12 مايكرولتر ، مختلطة بلطف مع ماصة ؛
3 اسحب 20 مايكرولتر من الخليط إلى شريحة الغرفة ؛
4. السماح للزنازين بالاستقرار في الغرفة لمدة دقيقة واحدة ؛
5. insect الشريحة في أداة Countstar FL ؛
6. اختر مقايسة "AO / PI Viability" ، ثم اختبرها بواسطة Countstar FL.
تحذير: AO و PI مادة مسرطنة محتملة.يوصى بأن يرتدي المشغل معدات الحماية الشخصية (PPE) لتجنب ملامسة الجلد والعينين مباشرة.
نتيجة:
1. صور المجال الساطع والفلورة من PBMC
صبغة AO و PI كلاهما يصبغ الحمض النووي في نواة الخلية للخلايا.لذلك ، فإن الصفائح الدموية أو خلايا الدم الحمراء أو الحطام الخلوي غير قادرة على التأثير على تركيز PBMCs ونتائج الجدوى.يمكن تمييز الخلايا الحية والخلايا الميتة والحطام بسهولة على أساس الصور التي تم إنشاؤها بواسطة FL (الشكل 1).
الشكل 2 صور الحقل والإضاءة الساطعة من PBMC
2. تركيز واستمرارية PBMC
تم تخفيف عينات PBMC في 2 و 4 و 8 و 16 مرة باستخدام PBS ، ثم تم تحضين هذه العينات بمزيج صبغة AO / PI وتحليلها بواسطة FL على التوالي.تظهر نتيجة تركيز وجدوى PBMC على النحو التالي:
