Perifeerisen veren mononukleaarisolut (PBMC:t) käsitellään usein erottamaan kokoverestä tiheysgradienttisentrifugoinnilla.Nämä solut koostuvat lymfosyyteistä (T-solut, B-solut, NK-solut) ja monosyyteistä, joita käytetään yleisesti immunologian, soluterapian, infektiotautien ja rokotteiden kehittämisen alalla.PBMC:n elinkelpoisuuden ja pitoisuuden seuranta ja analysointi on ratkaisevan tärkeää kliinisille laboratorioille, lääketieteen perustutkimukselle ja immuunisolutuotannolle.
Kuva 1. Eristetyt PBMC:t tuoreesta verestä tiheysgradienttisentrifugoinnilla
AOPI Dual-fluoresces Counting on määritystyyppi, jota käytetään solupitoisuuden ja elinkelpoisuuden havaitsemiseen.Liuos on yhdistelmä akridiinioranssia (vihreästi fluoresoiva nukleiinihappoväri) ja propidiumjodidia (punaisena fluoresoiva nukleiinihappoväri).Propidiumjodidi (PI) on kalvosulkuväri, joka pääsee vain soluihin, joiden kalvot ovat vahingoittuneet, kun taas akridiinioranssi pystyy tunkeutumaan populaation kaikkiin soluihin.Kun molemmat värit ovat läsnä ytimessä, propidiumjodidi vähentää akridiinioranssin fluoresenssia fluoresenssiresonanssienergiansiirron (FRET) avulla.Tämän seurauksena tumalliset solut, joissa on ehjät kalvot, värjäytyvät fluoresoivasti vihreiksi ja lasketaan eläviksi, kun taas tumalliset solut, joiden kalvot ovat vahingoittuneet, värjäävät vain fluoresoivan punaisen ja ne lasketaan kuolleiksi käytettäessä Countstar® FL -järjestelmää.Tumattomat materiaalit, kuten punasolut, verihiutaleet ja roskat, eivät fluoresoi, ja Countstar® FL -ohjelmisto jättää ne huomiotta.
Kokeellinen menettely:
1. Laimenna PBMC-näyte viiteen eri pitoisuuteen PBS:llä;
2. Lisää 12 µl AO/PI-liuosta 12 µl:aan näytettä varovasti pipetillä sekoitettuna;
3. Vedä 20 µl seosta kammiolevylle;
4.Anna solujen asettua kammioon noin 1 minuutin ajan;
5.Pidä objektilasi Countstar FL -instrumenttiin;
6.Valitse "AO/PI Viability" -määritys ja testaa sitten Countstar FL:llä.
Varoitus: AO ja PI ovat potentiaalisia karsinogeeneja.On suositeltavaa, että käyttäjä käyttää henkilökohtaisia suojavarusteita (PPE), jotta vältetään suora kosketus iholle ja silmiin.
Tulos:
1. PBMC:n kirkaskenttä- ja fluoresenssikuvat
AO- ja PI-väriaine ovat molemmat värjäys-DNA:ta solujen ytimessä.Siksi verihiutaleet, punasolut tai solujätteet eivät pysty vaikuttamaan PBMC-konsentraatioon ja elinkelpoisuuteen.Elävät solut, kuolleet solut ja roskat voidaan erottaa helposti Countstar FL:n luomien kuvien perusteella (kuva 1).
Kuva 2. PBMC:n kirkaskenttä- ja fluoresenssikuvat
2. PBMC:n keskittyminen ja elinkelpoisuus
PBMC-näytteet laimennettiin 2, 4, 8 ja 16 kertaa PBS:llä, sitten näitä näytteitä inkuboitiin AO/PI-väriseoksen kanssa ja analysoitiin vastaavasti Countstar FL:llä.PBMC:n pitoisuuden ja elinkelpoisuuden tulos on esitetty alla olevassa kuvassa:
