Ҳуҷайраҳои мононуклеарии хуни периферӣ (PBMCs) аксар вақт коркард карда мешаванд, то аз тамоми хун бо центрифугасияи градиентии зич ҷудо карда шаванд.Ин ҳуҷайраҳо аз лимфоситҳо (ҳуҷайраҳои Т, ҳуҷайраҳои В, ҳуҷайраҳои NK) ва моноситҳо иборатанд, ки маъмулан дар соҳаи иммунология, терапияи ҳуҷайра, бемориҳои сироятӣ ва таҳияи ваксина истифода мешаванд.Мониторинг ва таҳлили қобилиятнокӣ ва консентратсияи PBMC барои лабораторияҳои клиникӣ, тадқиқоти асосии илми тиб ва истеҳсоли ҳуҷайраҳои иммунӣ муҳим аст.
Расми 1. PBMC-и ҷудошуда аз хуни тоза бо центрифугаи градиентии зич
AOPI Ҳисобкунии дугонаи флуоресцентҳо як навъи таҳлилест, ки барои муайян кардани консентратсияи ҳуҷайра ва қобили ҳаёт истифода мешавад.Маҳлул омезиши афлесуни акридин (доғи кислотаи нуклеинӣ сабз-флуоресцентӣ) ва йодиди пропидиум (доғи сурх-флуоресцентии кислотаи нуклеинӣ) мебошад.Йодид пропидиум (PI) як ранги истисноии мембрана аст, ки танҳо ба ҳуҷайраҳои дорои мембранаҳои вайроншуда ворид мешавад, дар ҳоле ки афлесун акридин метавонад ба ҳама ҳуҷайраҳои популятсия ворид шавад.Вақте ки ҳарду ранг дар ядро мавҷуданд, йодиди пропидиум боиси коҳиши флуорессенсияи афлесунии акридин тавассути интиқоли энергияи резонанси флуоресцентӣ (FRET) мегардад.Дар натиҷа, ҳуҷайраҳои ядроӣ бо мембранаҳои солим ба ранги сабзи флуоресцентӣ ранг мекунанд ва ҳамчун зинда ҳисобида мешаванд, дар ҳоле ки ҳуҷайраҳои ядроӣ бо мембранаҳои осебдида танҳо ранги флуоресцентиро ранг мекунанд ва ҳангоми истифодаи системаи Countstar® FL мурда ҳисобида мешаванд.Маводи ядронашуда, аз қабили ҳуҷайраҳои сурх, тромбоцитҳо ва партовҳо флуорессия намекунанд ва аз ҷониби нармафзори Countstar® FL сарфи назар карда мешаванд.
Раванди таҷрибавӣ:
1.Dilute намунаи PBMC ба 5 консентратсияи гуногун бо PBS;
2. Ба намунаи 12мл маҳлули 12мл AO/PI илова кунед, бо пипетка бо нарм омехта кунед;
3.Омехтаи 20мл ба слайди камера кашед;
4.Иҷозат диҳед, ки ҳуҷайраҳо дар камера тақрибан 1 дақиқа ҷойгир шаванд;
5.Слайдро ба асбоби Countstar FL ҳашарот кунед;
6.Таҳлили "AO/PI Viability" -ро интихоб кунед, пас аз ҷониби Countstar FL озмоиш кунед.
Огоҳӣ: AO ва PI як канцерогени эҳтимолӣ мебошанд.Тавсия дода мешавад, ки оператор таҷҳизоти муҳофизати инфиродӣ (PPE) пӯшад, то аз тамоси мустақим бо пӯст ва чашм пешгирӣ кунад.
Натиҷа:
1.Тасвирҳои майдони дурахшон ва флуорессенси PBMC
Рангҳои AO ва PI ҳарду доғҳои ДНК дар ядрои ҳуҷайраҳои ҳуҷайра мебошанд.Аз ин рӯ, тромбоцитҳо, ҳуҷайраҳои сурхи хун ё партовҳои ҳуҷайравӣ наметавонанд ба консентратсияи PBMCs ва натиҷаи ҳаёт таъсир расонанд.Ҳуҷайраҳои зинда, ҳуҷайраҳои мурда ва партовҳоро дар асоси тасвирҳои аз ҷониби Countstar FL тавлидшуда ба осонӣ фарқ кардан мумкин аст (Расми 1).
Тасвири 2．Тасвирҳои майдони равшан ва флуорессенси PBMC
2. Консентратсия ва қобили ҳаёт будани PBMC
Намунаҳои PBMC дар 2, 4, 8 ва 16 маротиба бо PBS маҳлул карда шуданд, сипас он намунаҳо бо омехтаи рангҳои AO/PI инкубатсия карда шуданд ва мутаносибан аз ҷониби Countstar FL таҳлил карда шуданд.Натиҷаи консентратсия ва қобили зисти PBMC дар расми зерин нишон дода шудааст:
