เซลล์โมโนนิวเคลียร์ของเลือดส่วนปลาย (PBMC) มักถูกแปรรูปเพื่อแยกจากเลือดครบส่วนโดยการหมุนเหวี่ยงเกรเดียนท์ของความหนาแน่นเซลล์เหล่านี้ประกอบด้วยเซลล์ลิมโฟไซต์ (ทีเซลล์ บีเซลล์ เซลล์ NK) และโมโนไซต์ ซึ่งมักใช้ในด้านภูมิคุ้มกันวิทยา การบำบัดด้วยเซลล์ โรคติดเชื้อ และการพัฒนาวัคซีนการเฝ้าติดตามและวิเคราะห์ความมีชีวิตและความเข้มข้นของ PBMC เป็นสิ่งสำคัญสำหรับห้องปฏิบัติการทางคลินิก การวิจัยทางวิทยาศาสตร์การแพทย์ขั้นพื้นฐาน และการผลิตเซลล์ภูมิคุ้มกัน
รูปที่ 1 PBMC ที่แยกได้จากเลือดสดด้วยการปั่นเหวี่ยงเกรเดียนต์ของความหนาแน่น
การนับฟลูออเรสเซนต์คู่ของ AOPI เป็นประเภทการทดสอบที่ใช้สำหรับตรวจจับความเข้มข้นและความมีชีวิตของเซลล์สารละลายคือการรวมกันของสีส้ม acridine (คราบกรดนิวคลีอิกเรืองแสงสีเขียว) และโพรพิเดียมไอโอไดด์ (คราบกรดนิวคลีอิกเรืองแสงสีแดง)โพรพิเดียมไอโอไดด์ (PI) เป็นสีย้อมเพื่อการแยกเมมเบรนที่เข้าสู่เซลล์ที่มีเยื่อหุ้มเซลล์ที่ถูกบุกรุกเท่านั้น ในขณะที่ส้มอะคริดีนสามารถเจาะเซลล์ทั้งหมดในประชากรได้เมื่อสีย้อมทั้งสองมีอยู่ในนิวเคลียส โพรพิเดียมไอโอไดด์จะทำให้การเรืองแสงสีส้มของอะคริดีนลดลงโดยการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสง (FRET)ผลที่ได้คือ เซลล์นิวคลีเอตที่มีเยื่อหุ้มที่ไม่เสียหายจะย้อมสีเขียวเรืองแสงและถูกนับเป็นชีวิต ในขณะที่เซลล์ที่เกิดนิวคลีเอตที่มีเยื่อหุ้มเซลล์ที่ถูกบุกรุกจะย้อมเป็นสีแดงเรืองแสงเท่านั้น และจะถูกนับว่าตายเมื่อใช้ระบบ Countstar® FLวัสดุที่ไม่ใช่นิวเคลียส เช่น เซลล์เม็ดเลือดแดง เกล็ดเลือด และเศษซากจะไม่เรืองแสงและจะถูกละเว้นโดยซอฟต์แวร์ Countstar® FL
ขั้นตอนการทดลอง:
1.เจือจางตัวอย่าง PBMC เป็น 5 ความเข้มข้นที่แตกต่างกันด้วย PBS
2. เติมสารละลาย AO/PI 12µl ลงในตัวอย่าง 12µl ค่อยๆ ผสมกับปิเปต
3. วาดส่วนผสม 20µl ลงในสไลด์ห้อง
4.ปล่อยให้เซลล์ตั้งถิ่นฐานในห้องเพาะเลี้ยงประมาณ 1 นาที
5.แมลงสไลด์ลงในเครื่องดนตรี Countstar FL;
6. เลือกการทดสอบ “AO/PI Viability” จากนั้นทำการทดสอบโดย Countstar FL
ข้อควรระวัง: AO และ PI เป็นสารก่อมะเร็งขอแนะนำให้ผู้ปฏิบัติงานสวมอุปกรณ์ป้องกันส่วนบุคคล (PPE) เพื่อหลีกเลี่ยงไม่ให้สัมผัสกับผิวหนังและดวงตาโดยตรง
ผลลัพธ์:
1.ภาพสนามสว่างและภาพเรืองแสงของ PBMC
สีย้อม AO และ PI เป็นทั้งคราบ DNA ในนิวเคลียสของเซลล์ของเซลล์ดังนั้นเกล็ดเลือด เซลล์เม็ดเลือดแดง หรือเศษเซลล์จึงไม่ส่งผลต่อความเข้มข้นของ PBMC และผลการมีชีวิตเซลล์ที่มีชีวิต เซลล์ที่ตายแล้ว และเศษซากสามารถแยกแยะได้ง่ายตามภาพที่สร้างโดย Countstar FL (รูปที่ 1)
รูปที่ 2．Bright Field และภาพเรืองแสงของ PBMC
2.ความเข้มข้นและความมีชีวิตของ PBMC
ตัวอย่าง PBMC ถูกเจือจางใน 2, 4, 8 และ 16 ครั้งด้วย PBS จากนั้นตัวอย่างเหล่านั้นถูกบ่มด้วยของผสมสีย้อม AO/PI และวิเคราะห์โดย Countstar FL ตามลำดับผลลัพธ์ของความเข้มข้นและความมีชีวิตของ PBMC แสดงดังรูปด้านล่าง:
