As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) são frequentemente processadas para separar do sangue total por centrifugação em gradiente de densidade.Essas células são constituídas por linfócitos (células T, células B, células NK) e monócitos, comumente usados no campo da imunologia, terapia celular, doenças infecciosas e desenvolvimento de vacinas.Monitorar e analisar a viabilidade e concentração de PBMC é crucial para os laboratórios clínicos, pesquisa em ciências médicas básicas e produção de células imunes.
Fig 1. PBMC isolado de sangue fresco com centrifugação em gradiente de densidade
A contagem de fluorescência dupla AOPI é o tipo de ensaio usado para detectar a concentração e viabilidade das células.A solução é uma combinação de laranja de acridina (a coloração verde fluorescente de ácido nucleico) e iodeto de propídio (a coloração vermelha fluorescente de ácido nucleico).O iodeto de propídio (PI) é um corante de exclusão de membrana que entra apenas nas células com membranas comprometidas, enquanto o laranja de acridina é capaz de penetrar em todas as células de uma população.Quando ambos os corantes estão presentes no núcleo, o iodeto de propídio causa uma redução na fluorescência laranja de acridina por transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET).Como resultado, as células nucleadas com membranas intactas coram em verde fluorescente e são contadas como vivas, enquanto as células nucleadas com membranas comprometidas apenas coram em vermelho fluorescente e são contadas como mortas ao usar o sistema Countstar® FL.Materiais não nucleados, como glóbulos vermelhos, plaquetas e detritos, não fluorescem e são ignorados pelo software Countstar® FL.
Procedimento experimental:
1.Diluir a amostra de PBMC em 5 concentrações diferentes com PBS;
2.Adicione 12µl de solução AO/PI em 12µl de amostra, misturando suavemente com a pipeta;
3.Desenhe 20µl da mistura na lâmina da câmara;
4. Deixe as células assentarem na câmara por cerca de 1 minuto;
5.Insect a lâmina no instrumento Countstar FL;
6. Escolha o ensaio “AO/PI Viability” e teste pelo Countstar FL.
Atenção: AO e PI é um potencial cancerígeno.Recomenda-se que o operador use equipamento de proteção individual (EPI) para evitar o contato direto com a pele e os olhos.
Resultado:
1. Imagens de campo brilhante e fluorescência do PBMC
O corante AO e PI são ambos corantes de DNA no núcleo celular das células.Portanto, plaquetas, glóbulos vermelhos ou detritos celulares são incapazes de afetar a concentração de PBMCs e o resultado da viabilidade.Células vivas, células mortas e detritos podem ser facilmente distinguidos com base nas imagens geradas pelo Countstar FL (Figura 1).
Figura 2．Campo brilhante e imagens de fluorescência do PBMC
2. Concentração e Viabilidade de PBMC
As amostras de PBMC foram diluídas em 2, 4, 8 e 16 vezes com PBS, então essas amostras foram incubadas com uma mistura de corante AO/PI e analisadas pelo Countstar FL respectivamente.O resultado da concentração e viabilidade de PBMC é mostrado na figura abaixo:
