Periferik qon mononuklear hujayralari (PBMCs) ko'pincha zichlik gradienti santrifüjlash orqali butun qondan ajratish uchun qayta ishlanadi.Ushbu hujayralar limfotsitlar (T hujayralari, B hujayralari, NK hujayralari) va monotsitlardan iborat bo'lib, ular immunologiya, hujayra terapiyasi, yuqumli kasalliklar va vaktsinani ishlab chiqish sohasida keng qo'llaniladi.PBMC ning hayotiyligi va kontsentratsiyasini kuzatish va tahlil qilish klinik laboratoriyalar, asosiy tibbiyot fanlari tadqiqotlari va immun hujayra ishlab chiqarish uchun juda muhimdir.
1-rasm. Zichlik gradienti santrifüjlangan yangi qondan ajratilgan PBMC
AOPI Dual-fluoresces hisoblash hujayra konsentratsiyasi va hayotiyligini aniqlash uchun ishlatiladigan tahlil turidir.Eritma akridin apelsin (yashil lyuminestsent nuklein kislotasi dog'i) va propidiy yodid (qizil-flüoresan nuklein kislotasi dog'i) birikmasidan iborat.Propidium yodid (PI) membranani istisno qiluvchi bo'yoq bo'lib, u faqat buzilgan membranalari bo'lgan hujayralarga kiradi, akridin apelsin esa populyatsiyadagi barcha hujayralarga kira oladi.Ikkala bo'yoq yadroda mavjud bo'lganda, propidiy yodid floresan rezonans energiyasini uzatish (FRET) orqali akridin apelsin floresansining pasayishiga olib keladi.Natijada, membranalari buzilmagan yadroli hujayralar lyuminestsent yashil rangga bo'yaladi va tirik deb hisoblanadi, membranalari buzilgan yadroli hujayralar esa faqat lyuminestsent qizil rangga bo'yaladi va Countstar® FL tizimidan foydalanganda o'lik deb hisoblanadi.Qizil qon tanachalari, trombotsitlar va qoldiqlar kabi yadrosiz moddalar floresan nurlanmaydi va Countstar® FL dasturi tomonidan e'tiborga olinmaydi.
Eksperimental jarayon:
1.PBMC namunasini PBS bilan 5 xil konsentratsiyaga suyultiring;
2. 12 µl AO/PI eritmasini 12 µl namunaga qo‘shing, sekin pipetka bilan aralashtiring;
3. 20 µl aralashmani kamerali slaydga torting;
4.Hujayralarning kameraga taxminan 1 daqiqa joylashishiga ruxsat bering;
5.Slaydni Countstar FL asbobiga soling;
6. "AO/PI Viability" tahlilini tanlang, so'ngra Countstar FL tomonidan sinovdan o'tkazing.
Diqqat: AO va PI potentsial kanserogen hisoblanadi.Teri va ko'zlar bilan bevosita aloqa qilmaslik uchun operatorga shaxsiy himoya vositalarini (PPE) kiyish tavsiya etiladi.
Natija:
1.PBMC ning yorqin maydon va floresan tasvirlari
AO va PI bo'yoqlari hujayralar yadrosidagi DNKni bo'yashdir.Shuning uchun trombotsitlar, qizil qon tanachalari yoki hujayra qoldiqlari PBMC konsentratsiyasiga va hayotiylik natijasiga ta'sir qila olmaydi.Tirik hujayralar, o'lik hujayralar va qoldiqlarni Countstar FL tomonidan yaratilgan tasvirlar asosida osongina ajratish mumkin (1-rasm).
2-rasm．PBMC ning yorqin maydon va floresan tasvirlari
2.PBMCning kontsentratsiyasi va hayotiyligi
PBMC namunalari PBS bilan 2, 4, 8 va 16 marta suyultirildi, keyin bu namunalar AO/PI bo'yoq aralashmasi bilan inkubatsiya qilindi va mos ravishda Countstar FL tomonidan tahlil qilindi.PBMC kontsentratsiyasi va hayotiyligi natijasi quyidagi rasmda ko'rsatilgan:
