Perifera sango-mononukleaj ĉeloj (PBMCoj) ofte estas prilaboritaj por apartiĝi de tuta sango per densecgradientcentrifugo.Tiuj ĉeloj konsistas el limfocitoj (T-ĉeloj, B-ĉeloj, NK-ĉeloj) kaj monocitoj, ofte uzataj en la kampo de imunologio, ĉela terapio, infekta malsano kaj vakcina evoluo.Monitorado kaj analizado de daŭrigebleco kaj koncentriĝo de PBMC estas decidaj por la klinikaj laboratorioj, bazmedicinscienca esplorado kaj imunĉelproduktado.
Figo 1. Izolita PBMC de freŝa sango kun Densecgradienta centrifugado
AOPI Duobla-fluoreska kalkulado estas la analizspeco uzita por detektado de ĉelkoncentriĝo kaj daŭrigebleco.La solvo estas kombinaĵo de akridina oranĝo (la verd-fluoreska nuklea acida makulo) kaj propidiojodudo (la ruĝa-fluoreska nukleaacida makulo).Propidiojoduro (PI) estas membranekskludfarbo kiu nur eniras ĉelojn kun endanĝerigitaj membranoj, dum akridinaranĝo povas penetri ĉiujn ĉelojn en populacio.Kiam ambaŭ tinkturfarboj ĉeestas en la nukleo, propidiojoduro kaŭzas redukton en akridina oranĝa fluoreskeco per fluoreskeca resonanca energitransigo (FRET).Kiel rezulto, nukleaj ĉeloj kun sendifektaj membranoj makulas fluoreska verda kaj estas kalkulitaj kiel vivaj, dum nukleaj ĉeloj kun endanĝerigitaj membranoj nur makulas fluoreskan ruĝe kaj estas kalkulitaj kiel mortaj kiam ili uzas la Countstar® FL-sistemon.Nenuklea materialo kiel ruĝaj globuloj, trombocitoj kaj derompaĵoj ne fluoreskas kaj estas ignorataj de la programaro Countstar® FL.
Eksperimenta Proceduro:
1.Diluu la specimenon de PBMC en 5 malsamajn koncentriĝojn kun PBS;
2.Aldonu 12µl AO/PI-solvon en 12µl-specon, milde miksitan per pipeto;
3.Draw 20µl miksaĵo en kameran glitejon;
4.Lasu la ĉelojn ekloĝi en la ĉambro dum ĉirkaŭ 1 minuto;
5.Insektu la gliton en la instrumenton Countstar FL;
6.Elektu la provon "AO/PI Viability", tiam provu de Countstar FL.
Atentu: AO kaj PI estas ebla kancerogenaĵo.Oni rekomendas, ke la funkciigisto portu personan protektan ekipaĵon (PPE) por eviti rekte kontakton kun haŭto kaj okuloj.
Rezulto:
1.Brilaj Kampaj kaj Fluoreskaj bildoj de la PBMC
La AO kaj PI-farbo estas ambaŭ makuloj DNA en la ĉelkerno de ĉeloj.Tial trombocitoj, eritrocitoj aŭ ĉelaj derompaĵoj estas nekapablaj influi PBMCs-koncentriĝon kaj daŭrigeblecon.Vivantaj ĉeloj, mortaj ĉeloj kaj derompaĵoj povas esti facile distingitaj surbaze de la bildoj generitaj de Countstar FL (Figuro 1).
Figuro 2.Brilaj Kampoj kaj Fluoreskecaj bildoj de la PBMC
2.Koncentriĝo kaj Viability de PBMC
La PBMC-provaĵoj estis diluitaj en 2, 4, 8 kaj 16 fojojn kun PBS, tiam tiuj specimenoj estis kovataj kun AO/PI-tinkturfarbo-miksaĵo kaj analizitaj fare de Countstar FL respektive.La rezulto de koncentriĝo kaj daŭrigebleco de PBMC estas montrita kiel sub figuro:
