ಬಾಹ್ಯ ರಕ್ತ ಮಾನೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ಕೋಶಗಳನ್ನು (PBMCs) ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮೂಲಕ ಸಂಪೂರ್ಣ ರಕ್ತದಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ಸಂಸ್ಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಆ ಜೀವಕೋಶಗಳು ಲಿಂಫೋಸೈಟ್ಸ್ (T ಜೀವಕೋಶಗಳು, B ಜೀವಕೋಶಗಳು, NK ಜೀವಕೋಶಗಳು) ಮತ್ತು ಮೊನೊಸೈಟ್ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತವೆ, ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ರೋಗನಿರೋಧಕ, ಕೋಶ ಚಿಕಿತ್ಸೆ, ಸಾಂಕ್ರಾಮಿಕ ರೋಗ ಮತ್ತು ಲಸಿಕೆ ಅಭಿವೃದ್ಧಿ ಕ್ಷೇತ್ರದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಪ್ರಯೋಗಾಲಯಗಳು, ಮೂಲ ವೈದ್ಯಕೀಯ ವಿಜ್ಞಾನ ಸಂಶೋಧನೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ಕೋಶ ಉತ್ಪಾದನೆಗೆ PBMC ಯ ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯತೆ ಮತ್ತು ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡುವುದು ಮತ್ತು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸುವುದು ನಿರ್ಣಾಯಕವಾಗಿದೆ.
ಚಿತ್ರ 1. ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿಯೊಂದಿಗೆ ತಾಜಾ ರಕ್ತದಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾದ PBMC
AOPI ಡ್ಯುಯಲ್-ಫ್ಲೋರೊಸೆಸ್ ಎಣಿಕೆಯು ಜೀವಕೋಶದ ಸಾಂದ್ರತೆ ಮತ್ತು ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಬಳಸುವ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಪ್ರಕಾರವಾಗಿದೆ.ಪರಿಹಾರವು ಅಕ್ರಿಡಿನ್ ಕಿತ್ತಳೆ (ಹಸಿರು-ಪ್ರತಿದೀಪಕ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಸ್ಟೇನ್) ಮತ್ತು ಪ್ರೊಪಿಡಿಯಮ್ ಅಯೋಡೈಡ್ (ಕೆಂಪು-ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಸಿಡ್ ಸ್ಟೇನ್) ಸಂಯೋಜನೆಯಾಗಿದೆ.ಪ್ರೊಪಿಡಿಯಮ್ ಅಯೋಡೈಡ್ (PI) ಒಂದು ಪೊರೆಯ ಹೊರಗಿಡುವ ಬಣ್ಣವಾಗಿದ್ದು, ಇದು ಕೇವಲ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯ ಪೊರೆಗಳೊಂದಿಗೆ ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ಪ್ರವೇಶಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಅಕ್ರಿಡೈನ್ ಕಿತ್ತಳೆ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿನ ಎಲ್ಲಾ ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ಭೇದಿಸಬಲ್ಲದು.ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಎರಡೂ ಬಣ್ಣಗಳು ಇದ್ದಾಗ, ಪ್ರೊಪಿಡಿಯಮ್ ಅಯೋಡೈಡ್ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ರೆಸೋನೆನ್ಸ್ ಎನರ್ಜಿ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫರ್ (FRET) ಮೂಲಕ ಆಕ್ರಿಡೈನ್ ಕಿತ್ತಳೆ ಪ್ರತಿದೀಪಕದಲ್ಲಿ ಕಡಿತವನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುತ್ತದೆ.ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ, ಅಖಂಡ ಪೊರೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೇಟೆಡ್ ಕೋಶಗಳು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಹಸಿರು ಬಣ್ಣವನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಲೈವ್ ಎಂದು ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ರಾಜಿ ಪೊರೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೇಟೆಡ್ ಕೋಶಗಳು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣವನ್ನು ಮಾತ್ರ ಬಣ್ಣಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು Countstar® FL ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಬಳಸುವಾಗ ಸತ್ತಂತೆ ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೇಟೆಡ್ ಅಲ್ಲದ ವಸ್ತುಗಳಾದ ಕೆಂಪು ರಕ್ತ ಕಣಗಳು, ಪ್ಲೇಟ್‌ಲೆಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಶಿಲಾಖಂಡರಾಶಿಗಳು ಪ್ರತಿದೀಪಕವಾಗುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಅವುಗಳನ್ನು Countstar® FL ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ನಿರ್ಲಕ್ಷಿಸುತ್ತದೆ.
ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ವಿಧಾನ:
1. PBMC ಮಾದರಿಯನ್ನು PBS ನೊಂದಿಗೆ 5 ವಿಭಿನ್ನ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿ;
2.12µl ಮಾದರಿಗೆ 12µl AO/PI ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ, ನಿಧಾನವಾಗಿ ಪೈಪೆಟ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಬೆರೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ;
3.20µl ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಚೇಂಬರ್ ಸ್ಲೈಡ್‌ಗೆ ಎಳೆಯಿರಿ;
4. ಜೀವಕೋಶಗಳು ಸುಮಾರು 1 ನಿಮಿಷ ಕೊಠಡಿಯಲ್ಲಿ ನೆಲೆಗೊಳ್ಳಲು ಅನುಮತಿಸಿ;
5. ಸ್ಲೈಡ್ ಅನ್ನು ಕೌಂಟ್‌ಸ್ಟಾರ್ ಎಫ್‌ಎಲ್ ಉಪಕರಣಕ್ಕೆ ಕೀಟ ಹಾಕಿ;
6. "AO/PI ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯತೆ" ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಆರಿಸಿ, ನಂತರ Countstar FL ಮೂಲಕ ಪರೀಕ್ಷಿಸಿ.
ಎಚ್ಚರಿಕೆ: AO ಮತ್ತು PI ಸಂಭಾವ್ಯ ಕಾರ್ಸಿನೋಜೆನ್ ಆಗಿದೆ.ಚರ್ಮ ಮತ್ತು ಕಣ್ಣುಗಳೊಂದಿಗೆ ನೇರವಾಗಿ ಸಂಪರ್ಕವನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು ಆಪರೇಟರ್ ವೈಯಕ್ತಿಕ ರಕ್ಷಣಾ ಸಾಧನಗಳನ್ನು (PPE) ಧರಿಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.
ಫಲಿತಾಂಶ:
1.PBMC ಯ ಬ್ರೈಟ್ ಫೀಲ್ಡ್ ಮತ್ತು ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಚಿತ್ರಗಳು
AO ಮತ್ತು PI ಬಣ್ಣವು ಜೀವಕೋಶಗಳ ಜೀವಕೋಶದ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಕಲೆಗಳ DNAಗಳಾಗಿವೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಪ್ಲೇಟ್‌ಲೆಟ್‌ಗಳು, ಕೆಂಪು ರಕ್ತ ಕಣಗಳು ಅಥವಾ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಶಿಲಾಖಂಡರಾಶಿಗಳು PBMC ಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆ ಮತ್ತು ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯತೆಯ ಫಲಿತಾಂಶದ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುವುದಿಲ್ಲ.ಜೀವಂತ ಕೋಶಗಳು, ಸತ್ತ ಜೀವಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು ಶಿಲಾಖಂಡರಾಶಿಗಳನ್ನು ಕೌಂಟ್‌ಸ್ಟಾರ್ ಎಫ್‌ಎಲ್‌ನಿಂದ ರಚಿಸಲಾದ ಚಿತ್ರಗಳ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಸುಲಭವಾಗಿ ಗುರುತಿಸಬಹುದು (ಚಿತ್ರ 1).
ಚಿತ್ರ 2.PBMC ಯ ಬ್ರೈಟ್ ಫೀಲ್ಡ್ ಮತ್ತು ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಚಿತ್ರಗಳು
2. PBMC ಯ ಏಕಾಗ್ರತೆ ಮತ್ತು ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯತೆ
PBMC ಮಾದರಿಗಳನ್ನು PBS ನೊಂದಿಗೆ 2, 4, 8 ಮತ್ತು 16 ಬಾರಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು, ನಂತರ ಆ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು AO/PI ಡೈ ಮಿಶ್ರಣದೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕ್ರಮವಾಗಿ Countstar FL ನಿಂದ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು.PBMC ಯ ಏಕಾಗ್ರತೆ ಮತ್ತು ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯತೆಯ ಫಲಿತಾಂಶವನ್ನು ಕೆಳಗಿನ ಚಿತ್ರದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ:
