Att analysera leukocyterna i helblod är en rutinanalys i kliniskt laboratorium eller blodbank.Leukocyternas koncentration och livsduglighet är det vitala indexet som kvalitetskontroll av blodlagring.Förutom leukocyter innehåller helblod ett stort antal blodplättar, röda blodkroppar eller cellrester, vilket gör det omöjligt att analysera helblod direkt under mikroskopet eller ljusfältscellräknaren.Konventionella metoder för att räkna vita blodkroppar involverar RBC-lysprocess, vilket är tidskrävande.
AOPI Dual-fluoresces counting är den analystyp som används för att detektera cellkoncentration och livsduglighet.Lösningen är en kombination av akridin orange (den grönfluorescerande nukleinsyrafärgen) och propidiumjodid (den rödfluorescerande nukleinsyrafärgen).Propidiumjodid (PI) är ett membranexklusionsfärgämne som bara kommer in i celler med skadade membran, medan akridin orange kan penetrera alla celler i en population.När båda färgämnena är närvarande i kärnan, orsakar propidiumjodid en minskning av akridin orange fluorescens genom fluorescensresonansenergiöverföring (FRET).Som ett resultat färgas kärnförsedda celler med intakta membran fluorescerande grönt och räknas som levande, medan kärnförsedda celler med komprometterade membran endast färgas fluorescerande rött och räknas som döda när Countstar® Rigel-systemet används.
Countstar Rigel är en idealisk lösning för många komplexa cellpopulationskarakteriseringsanalyser, som gör det möjligt att snabbt analysera vita blodkroppar i helblod.
Experimentell procedur:
1.Ta 20 µl blodprov och späd provet i 180 µl PBS.
2. Tillsätt 12 µl AO/PI-lösning i 12 µl prov, försiktigt blandat med pipett;
3. Dra upp 20 µl blandning i kammarglaset;
4. Låt cellerna sätta sig i kammaren i cirka 1 minut;
5. Insektera objektglaset i Countstar FL-instrumentet;
6.Välj analysen "AO/PI Viability" och ange sedan prov-ID för detta prov.
7.Välj Spädningsförhållande, Celltyp, klicka på "Kör" för att starta testet.
Varning: AO och PI är potentiellt cancerframkallande.Det rekommenderas att operatören bär personlig skyddsutrustning (PPE) för att undvika direkt kontakt med hud och ögon.
Resultat:
1. Bright Field Bild av helblod
I den ljusa fältbilden av helblodet är WBC inte synliga bland de röda blodkropparna.(Figur 1)
Figur 1 Ljusfältsbild av helblod.
2. Fluorescensbild av helblod
AO- och PI-färgämnet är båda färgnings-DNA i cellkärnan i celler.Därför kan trombocyter, röda blodkroppar eller cellrester inte påverka leukocytkoncentrationen och livsduglighetsresultatet.Levande leukocyter (grön) och döda leukocyter (röd) visualiseras lätt i fluorescensbilderna.(Figur 2)
Figur 2 Fluorescensbilder av helblod.(A).Bild av AO Channel;(B) Bild av PI-kanal;(C) Slå samman bilder av AO och PI Channel.
3. Koncentration och livsduglighet av leukocyter
Countstar FL-mjukvaran räknar automatiskt celler i tre kammarsektioner och beräknar medelvärdet av totalt antal WBC-celler (1202), koncentration (1,83 x 106 celler/ml) och % viabilitet (82,04%).Helblodsbilderna och data kan enkelt exporteras som PDF, bild eller Excel för ytterligare analys eller dataarkivering.
Figur 3 Skärmbild av Countstar Rigel Software
