Sistemi Countstar kombinon citometrin e imazhit dhe numëruesin e qelizave në një instrument të vetëm në krye.Ky sistem i imazhit të qelizave të drejtuar nga aplikacioni, kompakt dhe i automatizuar ofron një zgjidhje gjithëpërfshirëse për kërkimin e qelizave kancerogjene, duke përfshirë numërimin e qelizave, qëndrueshmërinë (AO/PI, bluja blu), apoptozën (Annexin V-FITC/PI), qelizat ciklit (PI), dhe transfeksioni GFP/RFP.
Abstrakt
Kanceri është një nga shkaqet kryesore të vdekjeve në mbarë botën dhe zhvillimi i metodave të reja të trajtimit të kancerit është i një rëndësie të madhe.Qeliza e kancerit është objekti bazë i kërkimit të kancerit, informacione të ndryshme duhet të vlerësohen nga qeliza kanceroze.Kjo zonë kërkimore ka nevojë për analizë të shpejtë, të besueshme, të thjeshtë dhe të detajuar të qelizave.Sistemi Countstar ofron një platformë të thjeshtë zgjidhjeje për analizën e qelizave kancerogjene.
Studimi i Apoptozës së Qelizës së Kancerit nga Countstar Rigel
Analizat e apoptozës përdoren në mënyrë rutinore në shumë laboratorë për qëllime të ndryshme nga vlerësimi i shëndetit të kulturave qelizore deri te vlerësimi i toksicitetit të një paneli përbërësish.
Analiza e apoptozës është një lloj i përdorur për përcaktimin e përqindjes së apoptozës së qelizave me metodën e ngjyrosjes Annexin V-FITC/PI.Aneksina V lidhet me fosfatidilserinën (PS) me qelizën e hershme të apoptozës ose qelizën nekrozë.PI hyn vetëm në qelizat nekrotike / apoptotike në stadin shumë të vonë.(Figura 1)
A: Apoptoza e hershme Aneksin V (+), PI (-)
B: Apoptoza e vonë Aneksin V (+), PI (+)
Figura 1: Detaje të zmadhuara të fotografive të Countstar Rigel (5 x zmadhim) të 293 qelizave, të trajtuara me Annexin V FITC dhe PI
Analiza e ciklit qelizor të qelizave kancerogjene
Cikli qelizor ose cikli i ndarjes qelizore është seria e ngjarjeve që ndodhin në një qelizë që çon në ndarjen e saj dhe dyfishimin e ADN-së së saj (përsëritjen e ADN-së) për të prodhuar dy qeliza bija.Në qelizat me bërthamë, si te eukariotët, cikli qelizor ndahet gjithashtu në tre periudha: ndërfaza, faza mitotike (M) dhe citokineza.Jodidi i Propidiumit (PI) është një ngjyrues bërthamor që përdoret shpesh për të matur ciklin qelizor.Për shkak se boja nuk mund të hyjë në qelizat e gjalla, qelizat fiksohen me etanol para ngjyrosjes.Më pas të gjitha qelizat ngjyrosen.Qelizat që përgatiten për ndarje do të përmbajnë sasi në rritje të ADN-së dhe do të shfaqin fluoreshencë të rritur proporcionalisht.Ndryshimet në intensitetin e fluoreshencës përdoren për të përcaktuar përqindjen e qelizave në secilën fazë të ciklit qelizor.Countstar mund të kapë imazhin dhe rezultatet do të shfaqen në softuerin FCS Express.(Figura 2)
Figura 2: MCF-7 (A) dhe 293T (B) u ngjyrosën me Kit të Zbulimit të ciklit qelizor me PI, rezultatet u përcaktuan nga Countstar Rigel dhe u analizuan me FCS Express.
Qëndrueshmëria dhe Përcaktimi i Transfeksionit GFP në qelizë
Gjatë bioprocesit, GFP përdoret shpesh për t'u bashkuar me proteinën rekombinante si tregues.Përcaktoni GFP fluoreshente mund të reflektojë shprehjen e proteinës së synuar.Countstar Rigel ofron një analizë të shpejtë dhe të thjeshtë për testimin e transfektimit të GFP si dhe qëndrueshmërisë.Qelizat u ngjyrosën me jodur Propidium (PI) dhe Hoechst 33342 për të përcaktuar popullatën e qelizave të vdekura dhe popullsinë totale të qelizave.Countstar Rigel ofron një metodë të shpejtë dhe sasiore për vlerësimin e efikasitetit dhe qëndrueshmërisë së shprehjes GFP në të njëjtën kohë.(Figura 4)
Figura 4: Qelizat janë të vendosura duke përdorur Hoechst 33342 (blu) dhe përqindja e qelizave që shprehin GFP (jeshile) mund të përcaktohet lehtësisht.Qelizat e paqëndrueshme ngjyrosen me jodur propidium (PI; e kuqe).
Qëndrueshmëria dhe numri i qelizave
Numërimi i dyfishtë fluoresces AO/PI është lloji i analizës që përdoret për zbulimin e përqendrimit, qëndrueshmërisë së qelizave.Ai ndahet në numërimin e linjave qelizore dhe numërimin primar të qelizave sipas llojeve të ndryshme të qelizave.Tretësira përmban një kombinim të njollës së acidit nukleik me ngjyrë jeshile-fluoreshente, portokalli akridine dhe njollës së acidit nukleik të kuqefluoreshente, jodur propidium.Jodidi i Propidiumit është një bojë përjashtuese e membranës që hyn vetëm në qelizat me membrana të dëmtuara, ndërsa akridina portokalli depërton në të gjitha qelizat e një popullate.Kur të dyja ngjyrat janë të pranishme në bërthamë, jodidi i propidiumit shkakton një reduktim të fluoreshencës portokalli të akridinës nga transferimi i energjisë së rezonancës fluoreshente (FRET).Si rezultat, qelizat me bërthama me membrana të paprekura ngjyrosin ngjyrën e gjelbër fluoreshente dhe numërohen si të gjalla, ndërsa qelizat me bërthama me membrana të dëmtuara njollosin vetëm të kuqe fluoreshente dhe llogariten si të vdekura kur përdorin sistemin Countstar Rigel.Materiali pa bërthama si qelizat e kuqe të gjakut, trombocitet dhe mbeturinat nuk fluoreshenojnë dhe injorohen nga softueri Countstar Rigel.(Figura 5)
Figura 5: Countstar ka optimizuar një metodë ngjyrosjeje me fluoreshencë të dyfishtë për përcaktimin e thjeshtë dhe të saktë të përqendrimit dhe qëndrueshmërisë së PBMC.Mostrat e ngjyrosura me AO/PI mund të analizohen me Counstar Rigel
