Countstari süsteem ühendab kujutise tsütomeetri ja rakuloenduri üheks lauapealseks seadmeks.See rakenduspõhine, kompaktne ja automatiseeritud raku kujutise süsteem pakub kõikehõlmavat lahendust vähirakkude uurimiseks, sealhulgas rakkude loendamine, elujõulisus (AO/PI, trüpaansinine), apoptoos (Annexin V-FITC/PI), rakud. tsükkel (PI) ja GFP/RFP transfektsioon.
Abstraktne
Vähk on maailmas üks peamisi surmapõhjuseid ning uute vähiravimeetodite väljatöötamine on väga oluline.Vähirakk on vähi alusuuringute objekt, vähirakust on vaja hinnata mitmesugust informatsiooni.See uurimisvaldkond vajab kiiret, usaldusväärset, lihtsat ja üksikasjalikku rakuanalüüsi.Countstari süsteem pakub lihtsat lahendusplatvormi vähirakkude analüüsiks.
Countstar Rigeli uurige vähirakkude apoptoosi
Apoptoosianalüüse kasutatakse rutiinselt paljudes laborites erinevatel eesmärkidel alates rakukultuuride tervise hindamisest kuni ühendite paneeli toksilisuse hindamiseni.
Apoptoosianalüüs on tüüp, mida kasutatakse rakkude apoptoosiprotsendi määramiseks anneksiin V-FITC/PI värvimismeetodi abil.Anneksiin V seondub fosfatidüülseriiniga (PS) varase apoptoosi või nekroosirakuga.PI siseneb ainult nekrootilistesse / väga hilises staadiumis apoptootilistesse rakkudesse.(Joonis 1)
A: Varajane apoptoos anneksiin V (+), PI (-)
B: hiline apoptoos anneksiin V (+), PI (+)
Joonis 1: Countstar Rigeli piltide suurendatud üksikasjad (5-kordne suurendus) 293 rakust, töödeldud anneksiin V FITC ja PI-ga
Vähirakkude rakutsükli analüüs
Rakutsükkel või raku jagunemise tsükkel on sündmuste jada, mis toimub rakus, mis viib selle jagunemiseni ja DNA dubleerimiseni (DNA replikatsioon), mille tulemusena tekib kaks tütarrakku.Tuumaga rakkudes, nagu eukarüootides, jaguneb rakutsükkel samuti kolmeks perioodiks: interfaas, mitootiline (M) faas ja tsütokinees.Propiidiumjodiid (PI) on tuuma värviv värv, mida kasutatakse sageli rakutsükli mõõtmiseks.Kuna värvaine ei pääse elusrakkudesse, fikseeritakse rakud enne värvimist etanooliga.Seejärel värvitakse kõik rakud.Jagunemiseks valmistuvad rakud sisaldavad üha suuremas koguses DNA-d ja neil on proportsionaalselt suurenenud fluorestsents.Fluorestsentsi intensiivsuse erinevusi kasutatakse rakkude protsendi määramiseks rakutsükli igas faasis.Countstar suudab pildi jäädvustada ja tulemused kuvatakse FCS ekspresstarkvaras.(Joonis 2)
Joonis 2: MCF-7 (A) ja 293T (B) värviti rakutsükli tuvastamise komplektiga PI-ga, tulemused määrati Countstar Rigeliga ja analüüsiti FCS ekspressiga.
Elujõulisuse ja GFP transfektsiooni määramine rakkudes
Bioprotsessi käigus kasutatakse GFP-d sageli indikaatorina rekombinantse valguga sulandumiseks.Määrake, et GFP fluorestseeruv võib peegeldada sihtvalgu ekspressiooni.Countstar Rigel pakub kiiret ja lihtsat analüüsi nii GFP transfektsiooni kui ka elujõulisuse testimiseks.Surnud rakkude populatsiooni ja kogu rakkude populatsiooni määratlemiseks värviti rakud propiidiumjodiidi (PI) ja Hoechst 33342-ga.Countstar Rigel pakub kiiret ja kvantitatiivset meetodit GFP ekspressiooni tõhususe ja elujõulisuse samaaegseks hindamiseks.(Joonis 4)
Joonis 4: Rakud paiknevad Hoechst 33342 (sinine) abil ja GFP-d ekspresseerivate rakkude protsenti (roheline) saab hõlpsasti määrata.Mitteelujõulised rakud värvitakse propiidiumjodiidiga (PI; punane).
Elujõulisus ja rakkude arv
AO/PI Dual-fluoresces counting on testitüüp, mida kasutatakse rakkude kontsentratsiooni ja elujõulisuse tuvastamiseks.See jagunes vastavalt erinevatele rakutüüpidele rakuliinide loendamiseks ja primaarseks rakkude loendamiseks.Lahus sisaldab kombinatsiooni roheliselt fluorestseeruvast nukleiinhappevärvist, akridiinoranžist ja punaselt fluorestseeruvast nukleiinhappevärvist, propiidiumjodiidist.Propiidiumjodiid on membraani välistav värv, mis siseneb ainult kahjustatud membraanidega rakkudesse, samas kui akridiinoranž tungib kõigisse populatsiooni rakkudesse.Kui tuumas on mõlemad värvained, vähendab propiidiumjodiid akridiinoranži fluorestsentsi fluorestsentsresonantsenergia ülekande (FRET) abil.Selle tulemusena värvuvad tervete membraanidega tuumaga rakud fluorestseeruvalt roheliseks ja neid loetakse elavateks, samas kui kahjustatud membraanidega tuumarakud värvivad ainult fluorestseeruvat punast ja loetakse Countstar Rigeli süsteemi kasutamisel surnuks.Tuumata materjalid, nagu punased verelibled, trombotsüüdid ja praht, ei fluorestseeru ja Countstar Rigeli tarkvara ignoreerib neid.(Joonis 5)
Joonis 5: Countstar on optimeerinud kahe fluorestsentsvärvimise meetodi PBMC kontsentratsiooni ja elujõulisuse lihtsaks ja täpseks määramiseks.AO/PI-ga värvitud proove saab analüüsida Countstar Rigeliga
