Il sistema Countstar combina il citometro a immagine e il contatore di cellule in un unico strumento da banco.Questo sistema di imaging cellulare compatto e automatizzato basato sull'applicazione fornisce una soluzione all-in-one per la ricerca sulle cellule tumorali, incluso il conteggio delle cellule, la vitalità (AO/PI, trypan blue), l'apoptosi (Annexin V-FITC/PI), le cellule ciclo (PI) e trasfezione GFP/RFP.
Astratto
Il cancro è una delle principali cause di morte nel mondo e lo sviluppo di nuovi metodi di trattamento del cancro è di grande importanza.La cellula cancerosa è l'oggetto di ricerca di base del cancro, varie informazioni devono essere valutate dalla cellula cancerosa.Questa area di ricerca necessita di analisi cellulari rapide, affidabili, semplici e dettagliate.Il sistema Countstar fornisce una piattaforma di soluzione semplice per l'analisi delle cellule tumorali.
Studio sull'apoptosi delle cellule tumorali di Countstar Rigel
I saggi di apoptosi sono usati di routine in molti laboratori per vari scopi, dalla valutazione della salute delle colture cellulari alla valutazione della tossicità di un pannello di composti.
Il test dell'apoptosi è un tipo utilizzato per determinare la percentuale di apoptosi delle cellule mediante il metodo di colorazione dell'allegato V-FITC/PI.L'annessina V si lega alla fosfatidilserina (PS) con cellule di apoptosi precoce o cellule di necrosi.Il PI entra solo nelle cellule apoptotiche necrotiche/molto avanzate.(Figura 1)
A： Apoptosi precoce Annessina V (+), PI (-)
B: apoptosi tardiva, annessina V (+), PI (+)
Figura1: Dettagli ingranditi delle immagini di Countstar Rigel (ingrandimento 5 x) di 293 cellule, trattate con annessina V FITC e PI
Analisi del ciclo cellulare della cellula cancerosa
Il ciclo cellulare o ciclo di divisione cellulare è la serie di eventi che si verificano in una cellula che porta alla sua divisione e duplicazione del suo DNA (replicazione del DNA) per produrre due cellule figlie.Nelle cellule con un nucleo, come negli eucarioti, anche il ciclo cellulare è suddiviso in tre periodi: l'interfase, la fase mitotica (M) e la citochinesi.Lo ioduro di propidio (PI) è un colorante nucleare che viene spesso utilizzato per misurare il ciclo cellulare.Poiché il colorante non può entrare nelle cellule vive, le cellule vengono fissate con etanolo prima della colorazione.Tutte le cellule vengono quindi colorate.Le cellule che si preparano alla divisione conterranno quantità crescenti di DNA e mostreranno una fluorescenza proporzionalmente aumentata.Le differenze nell'intensità della fluorescenza vengono utilizzate per determinare la percentuale di cellule in ciascuna fase del ciclo cellulare.Countstar può acquisire l'immagine e i risultati verranno visualizzati nel software FCS express.(Figura 2)
Figura 2: MCF-7 (A) e 293T (B) sono stati colorati con il kit di rilevamento del ciclo cellulare con PI, i risultati sono stati determinati da Countstar Rigel e analizzati da FCS express.
Determinazione della vitalità e della trasfezione GFP nella cellula
Durante il bioprocesso, la GFP viene spesso utilizzata per fondersi con la proteina ricombinante come indicatore.Determinare la fluorescenza GFP può riflettere l'espressione della proteina bersaglio.Countstar Rigel offre un test semplice e veloce per testare la trasfezione GFP e la vitalità.Le cellule sono state colorate con ioduro di propidio (PI) e Hoechst 33342 per definire la popolazione di cellule morte e la popolazione cellulare totale.Countstar Rigel offre un metodo rapido e quantitativo per valutare l'efficienza e la vitalità dell'espressione GFP allo stesso tempo.(Figura 4)
Figura 4: le cellule si trovano utilizzando Hoechst 33342 (blu) e la percentuale di cellule che esprimono GFP (verde) può essere facilmente determinata.Le cellule non vitali sono colorate con ioduro di propidio (PI; rosso).
Viabilità e numero di cellule
AO/PI Il conteggio a doppia fluorescenza è il tipo di test utilizzato per rilevare la concentrazione cellulare e la vitalità.Si divideva in conteggio delle linee cellulari e conteggio delle cellule primarie in base al diverso tipo di cellula.La soluzione contiene una combinazione del colorante verde fluorescente dell'acido nucleico, arancione acridina, e del colorante rosso fluorescente dell'acido nucleico, ioduro di propidio.Lo ioduro di propidio è un colorante di esclusione della membrana che entra solo nelle cellule con membrane compromesse mentre l'arancio di acridina penetra in tutte le cellule di una popolazione.Quando entrambi i coloranti sono presenti nel nucleo, lo ioduro di propidio provoca una riduzione della fluorescenza arancione di acridina mediante trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET).Di conseguenza, le cellule nucleate con membrane intatte si colorano di verde fluorescente e vengono conteggiate come vive, mentre le cellule nucleate con membrane compromesse si colorano solo di rosso fluorescente e vengono conteggiate come morte quando si utilizza il sistema Countstar Rigel.Il materiale non nucleato come globuli rossi, piastrine e detriti non emette fluorescenza e viene ignorato dal software Countstar Rigel.(Figura 5)
Figura 5: Countstar ha ottimizzato un metodo di colorazione a doppia fluorescenza per una determinazione semplice e accurata della concentrazione e della vitalità di PBMC.I campioni colorati con AO/PI possono essere analizzati con il Counstar Rigel
