Countstar sistema sujungia vaizdo citometrą ir ląstelių skaitiklį į vieną ant stalo esantį prietaisą.Ši programa valdoma, kompaktiška ir automatizuota ląstelių vaizdavimo sistema yra „viskas viename“ sprendimas vėžio ląstelių tyrimams, įskaitant ląstelių skaičiavimą, gyvybingumą (AO/PI, tripano mėlynasis), apoptozę (Aneksino V-FITC/PI), ląsteles. ciklas (PI) ir GFP/RFP transfekcija.
Abstraktus
Vėžys yra viena iš pagrindinių mirties priežasčių visame pasaulyje, o naujų vėžio gydymo metodų kūrimas yra labai svarbus.Vėžinė ląstelė yra pagrindinis vėžio tyrimo objektas, iš vėžinės ląstelės reikia įvertinti įvairią informaciją.Šiai tyrimų sričiai reikalinga greita, patikima, paprasta ir išsami ląstelių analizė.Countstar sistema suteikia paprastą sprendimo platformą vėžio ląstelių analizei.
„Countstar Rigel“ ištirkite vėžio ląstelių apoptozę
Apoptozės tyrimai yra įprastai naudojami daugelyje laboratorijų įvairiems tikslams – nuo ląstelių kultūrų būklės įvertinimo iki junginių grupės toksiškumo įvertinimo.
Apoptozės tyrimas yra tipas, naudojamas ląstelių apoptozės procentinei daliai nustatyti aneksino V-FITC/PI dažymo metodu.Aneksinas V jungiasi su fosfatidilserinu (PS) su ankstyva apoptozės ląstele arba nekrozės ląstele.PI patenka tik į nekrozines / labai vėlyvos apoptozės ląsteles.(Figūra 1)
A: Ankstyva apoptozė aneksinas V (+), PI (-)
B: Vėlyva apoptozė aneksinas V (+), PI (+)
1 paveikslas: padidintos Countstar Rigel nuotraukų detalės (5x padidinimas) iš 293 ląstelių, apdorotų anneksinu V FITC ir PI
Vėžio ląstelių ciklo analizė
Ląstelių ciklas arba ląstelių dalijimosi ciklas yra įvykių, vykstančių ląstelėje, serija, dėl kurios ji dalijasi ir dubliuojasi jos DNR (DNR replikacija), kad susidarytų dvi dukterinės ląstelės.Ląstelėse su branduoliu, kaip ir eukariotuose, ląstelių ciklas taip pat skirstomas į tris periodus: tarpfazę, mitozinę (M) fazę ir citokinezę.Propidžio jodidas (PI) yra branduolį dažantis dažiklis, dažnai naudojamas ląstelių ciklui matuoti.Kadangi dažai negali patekti į gyvas ląsteles, ląstelės prieš dažymą fiksuojamos etanoliu.Tada visos ląstelės yra nudažytos.Dalijimuisi besiruošiančiose ląstelėse bus vis daugiau DNR ir proporcingai padidėja fluorescencija.Fluorescencijos intensyvumo skirtumai naudojami ląstelių procentiniam kiekiui kiekvienoje ląstelių ciklo fazėje nustatyti.Countstar gali užfiksuoti vaizdą, o rezultatai bus rodomi FCS express programinėje įrangoje.(2 pav.)
2 pav. MCF-7 (A) ir 293T (B) buvo nudažyti naudojant ląstelių ciklo aptikimo rinkinį su PI, rezultatai nustatyti Countstar Rigel ir analizuoti FCS express.
Gyvybingumo ir GFP transfekcijos nustatymas ląstelėje
Bioproceso metu GFP dažnai naudojamas kaip indikatorius susilieti su rekombinantiniu baltymu.Nustatykite, kad GFP fluorescencinė gali atspindėti tikslinio baltymo ekspresiją.Countstar Rigel siūlo greitą ir paprastą GFP transfekcijos ir gyvybingumo testą.Ląstelės buvo nudažytos propidžio jodidu (PI) ir Hoechst 33342, kad būtų galima nustatyti negyvų ląstelių populiaciją ir bendrą ląstelių populiaciją.„Countstar Rigel“ siūlo greitą, kiekybinį metodą, leidžiantį įvertinti GFP išraiškos efektyvumą ir gyvybingumą tuo pačiu metu.(4 pav.)
4 pav. Ląstelės nustatomos naudojant Hoechst 33342 (mėlyna) ir galima lengvai nustatyti GFP ekspresuojančių ląstelių procentą (žalia).Negyvybingos ląstelės nudažomos propidžio jodidu (PI; raudona).
Gyvybingumas ir ląstelių skaičius
AO/PI dvigubo fluorescencijos skaičiavimas yra tyrimo tipas, naudojamas ląstelių koncentracijai ir gyvybingumui nustatyti.Jis skirstomas į ląstelių linijų skaičiavimą ir pirminį ląstelių skaičiavimą pagal skirtingus ląstelių tipus.Tirpale yra žaliai fluorescencinės nukleino rūgšties dėmės, akridino oranžinės spalvos, ir raudonai fluorescencinės nukleino rūgšties dėmės propidžio jodido derinys.Propidžio jodidas yra membraną išskiriantys dažai, kurie patenka tik į ląsteles su pažeistomis membranomis, o akridino apelsinas prasiskverbia į visas populiacijos ląsteles.Kai branduolyje yra abiejų dažiklių, propidžio jodidas sumažina akridino oranžinės spalvos fluorescenciją dėl fluorescencinio rezonanso energijos perdavimo (FRET).Dėl to branduolinės ląstelės su nepažeistomis membranomis nusidažo fluorescuojančia žalia spalva ir yra skaičiuojamos kaip gyvos, o branduolinės ląstelės su pažeistomis membranomis nusidažo tik fluorescuojančia raudona spalva ir, naudojant Countstar Rigel sistemą, skaičiuojamos kaip negyvos.Nebranduolinės medžiagos, tokios kaip raudonieji kraujo kūneliai, trombocitai ir šiukšlės, nefluorescuoja ir Countstar Rigel programinė įranga į jas nepaiso.(5 pav.)
5 pav. Countstar optimizavo dvigubo fluorescencinio dažymo metodą, kad būtų galima paprastai ir tiksliai nustatyti PBMC koncentraciją ir gyvybingumą.Mėginius, nudažytus AO/PI, galima analizuoti naudojant Countstar Rigel
