Countstar համակարգը միավորում է պատկերի ցիտոմետրը և բջջային հաշվիչը՝ մեկ նստարանային գործիքի մեջ:Այս հավելվածի վրա հիմնված, կոմպակտ և ավտոմատացված բջիջների պատկերման համակարգը ապահովում է քաղցկեղի բջիջների հետազոտության բոլորը մեկ լուծում, ներառյալ բջիջների հաշվարկը, կենսունակությունը (AO/PI, տրիպան կապույտ), ապոպտոզը (Annexin V-FITC/PI), բջիջները: ցիկլը (PI) և GFP/RFP տրանսֆեկցիան:
Վերացական
Քաղցկեղն ամբողջ աշխարհում մահվան հիմնական պատճառներից մեկն է, և քաղցկեղի բուժման նոր մեթոդների մշակումը մեծ նշանակություն ունի։Քաղցկեղի բջիջը քաղցկեղի հիմնական հետազոտական օբյեկտն է, քաղցկեղի բջջից անհրաժեշտ է տարբեր տեղեկություններ գնահատել:Այս հետազոտական տարածքը բջիջների արագ, հուսալի, պարզ և մանրամասն վերլուծության կարիք ունի:Countstar համակարգը ապահովում է քաղցկեղի բջիջների վերլուծության պարզ լուծման հարթակ:
Քաղցկեղի բջիջների ապոպտոզի ուսումնասիրություն Քաունսթար Ռիգելի կողմից
Ապոպտոզի անալիզները սովորաբար օգտագործվում են բազմաթիվ լաբորատորիաներում տարբեր նպատակներով՝ սկսած բջջային կուլտուրաների առողջության գնահատումից մինչև միացությունների վահանակի թունավորության գնահատումը:
Ապոպտոզի վերլուծությունը մի տեսակ է, որն օգտագործվում է Annexin V-FITC/PI ներկման մեթոդով բջիջների ապոպտոզի տոկոսը որոշելու համար:Annexin V-ը կապվում է ֆոսֆատիդիլսերինին (PS) վաղ ապոպտոզի բջիջով կամ նեկրոզի բջիջով:PI-ն մտնում է միայն նեկրոտիկ/շատ ուշ փուլի ապոպտոտիկ բջիջներ:(Նկար 1)
A: Վաղ ապոպտոզ Annexin V (+), PI (-)
B: Ուշ ապոպտոզ Annexin V (+), PI (+)
Նկար 1. Countstar Rigel նկարների (5 x խոշորացում) 293 բջիջների ընդլայնված մանրամասներ՝ մշակված Annexin V FITC-ով և PI-ով:
Քաղցկեղի բջիջների բջջային ցիկլի վերլուծություն
Բջջային ցիկլը կամ բջիջների բաժանման ցիկլը այն իրադարձությունների շարքն է, որոնք տեղի են ունենում բջջում, ինչը հանգեցնում է նրա բաժանմանը և նրա ԴՆԹ-ի կրկնօրինակմանը (ԴՆԹ-ի վերարտադրության)՝ առաջացնելով երկու դուստր բջիջ:Միջուկ ունեցող բջիջներում, ինչպես էուկարիոտներում, բջջային ցիկլը նույնպես բաժանվում է երեք շրջանի՝ ինտերֆազ, միտոտիկ (M) փուլ և ցիտոկինեզ։Propidium iodide (PI) միջուկային ներկանյութ է, որը հաճախ օգտագործվում է բջջային ցիկլը չափելու համար:Քանի որ ներկը չի կարող մտնել կենդանի բջիջներ, բջիջները ամրացվում են էթանոլով ներկելուց առաջ:Այնուհետև բոլոր բջիջները ներկվում են:Բաժանման համար պատրաստվող բջիջները կպարունակեն աճող քանակությամբ ԴՆԹ և կցուցադրեն համամասնորեն աճող ֆլյուորեսցենտ:Ֆլյուորեսցենցիայի ինտենսիվության տարբերությունները օգտագործվում են բջջային ցիկլի յուրաքանչյուր փուլում բջիջների տոկոսը որոշելու համար:Countstar-ը կարող է նկարել պատկերը, և արդյունքները կցուցադրվեն FCS Express ծրագրաշարում:(Նկար 2)
Նկար 2. MCF-7 (A) և 293T (B) ներկվել են բջջային ցիկլի հայտնաբերման հավաքածուով PI-ով, արդյունքները որոշվել են Countstar Rigel-ի կողմից և վերլուծվել FCS Express-ով:
Կենսունակությունը և GFP-ի տրանսֆեկցիայի որոշումը բջջում
Կենսամշակման ընթացքում GFP-ն հաճախ օգտագործվում է ռեկոմբինանտ սպիտակուցի հետ միաձուլվելու համար՝ որպես ցուցիչ:Որոշեք, որ GFP լյումինեսցենտը կարող է արտացոլել թիրախային սպիտակուցի արտահայտությունը:Countstar Rigel-ն առաջարկում է արագ և պարզ վերլուծություն GFP-ի տրանսֆեկցիան, ինչպես նաև կենսունակությունը ստուգելու համար:Բջիջները ներկվել են պրոպիդիումի յոդիդով (PI) և Hoechst 33342-ով՝ որոշելու մահացած բջիջների պոպուլյացիան և բջիջների ընդհանուր պոպուլյացիան:Countstar Rigel-ն առաջարկում է արագ, քանակական մեթոդ GFP-ի արտահայտման արդյունավետությունը և միաժամանակ կենսունակությունը գնահատելու համար:(Նկար 4)
Նկար 4. Բջիջները տեղակայված են Hoechst 33342 (կապույտ) օգտագործմամբ, և GFP արտահայտող բջիջների տոկոսը (կանաչ) հեշտությամբ կարելի է որոշել:Ոչ կենսունակ բջիջները ներկված են պրոպիդիումի յոդիդով (PI; կարմիր):
Կենսունակություն և բջիջների քանակ
AO/PI երկակի ֆլյուորեսցեսային հաշվումը վերլուծության տեսակն է, որն օգտագործվում է բջիջների կոնցենտրացիան, կենսունակությունը հայտնաբերելու համար:Այն բաժանվում է բջջային գծերի հաշվման և առաջնային բջիջների հաշվարկի՝ ըստ տարբեր բջիջների տեսակի:Լուծույթը պարունակում է կանաչ-ֆլուորեսցենտ նուկլեինաթթվի բիծի, ակրիդին նարնջագույնի և կարմիր ֆլուորեսցենտ նուկլեինաթթվի բիծի` պրոպիդիումի յոդիդի համակցություն:Propidium iodide-ը մեմբրանի բացառող ներկ է, որը մտնում է միայն վնասված թաղանթներով բջիջներ, մինչդեռ ակրիդին նարնջագույնը թափանցում է պոպուլյացիայի բոլոր բջիջները:Երբ երկու ներկերն էլ առկա են միջուկում, պրոպիդիումի յոդիդը հանգեցնում է ակրիդինային նարնջի ֆլուորեսցենտության նվազեցմանը ֆլյուորեսցենտային ռեզոնանսային էներգիայի փոխանցման (FRET) միջոցով:Արդյունքում, անձեռնմխելի թաղանթներով միջուկավորված բջիջները ներկում են լյումինեսցենտ կանաչ և համարվում են կենդանի, մինչդեռ վնասված թաղանթներով միջուկավորված բջիջները ներկում են միայն լյումինեսցենտ կարմիր և համարվում են մեռած՝ Countstar Rigel համակարգը օգտագործելիս:Ոչ միջուկային նյութերը, ինչպիսիք են արյան կարմիր բջիջները, թրոմբոցիտները և բեկորները, չեն լուսանում և անտեսվում են Countstar Rigel ծրագրաշարի կողմից:(Նկար 5)
Նկար 5. Countstar-ը օպտիմալացրել է երկակի ֆլուորեսցենտային ներկման մեթոդը PBMC-ի կոնցենտրացիայի և կենսունակության պարզ, ճշգրիտ որոշման համար:AO/PI-ով ներկված նմուշները կարող են վերլուծվել Counstar Rigel-ով
