Countstar-järjestelmä yhdistää kuvasytometrin ja solulaskurin yhdeksi pöytäkoneelle.Tämä sovelluslähtöinen, kompakti ja automatisoitu solukuvausjärjestelmä tarjoaa all-in-one-ratkaisun syöpäsolututkimukseen, mukaan lukien solujen laskeminen, elinkelpoisuus (AO/PI, trypaaninsininen), apoptoosi (Annexin V-FITC/PI), solu sykli (PI) ja GFP/RFP-transfektio.
Abstrakti
Syöpä on yksi tärkeimmistä kuolinsyistä maailmanlaajuisesti, ja uusien syövänhoitomenetelmien kehittäminen on erittäin tärkeää.Syöpäsolu on syövän perustutkimuskohde, syöpäsolusta on arvioitava erilaista tietoa.Tämä tutkimusalue tarvitsee nopeaa, luotettavaa, yksinkertaista ja yksityiskohtaista soluanalyysiä.Countstar-järjestelmä tarjoaa yksinkertaisen ratkaisualustan syöpäsoluanalyysiin.
Countstar Rigelin tutkiminen syöpäsolujen apoptoosista
Apoptoosimäärityksiä käytetään rutiininomaisesti monissa laboratorioissa erilaisiin tarkoituksiin soluviljelmien terveyden arvioinnista yhdisteiden paneelin toksisuuden arviointiin.
Apoptoosimääritys on tyyppi, jota käytetään solujen apoptoosiprosentin määrittämiseen anneksiini V-FITC/PI -värjäysmenetelmällä.Anneksiini V sitoutuu fosfatidyyliseriiniin (PS) varhaisen apoptoosisolun tai nekroosisolun kanssa.PI pääsee vain nekroottisiin/erittäin myöhäisen vaiheen apoptoottisiin soluihin.(Kuvio 1)
A: Varhainen apoptoosi anneksiini V (+), PI (-)
B: Myöhäinen apoptoosi anneksiini V (+), PI (+)
Kuva 1: Suurennettuja yksityiskohtia Countstar Rigel -kuvista (5-kertainen suurennus) 293-soluista, jotka on käsitelty Annexin V FITC:llä ja PI:llä
Syöpäsolujen syklin analyysi
Solusykli tai solunjakautumissykli on sarja tapahtumia, jotka tapahtuvat solussa, mikä johtaa sen jakautumiseen ja sen DNA:n kaksinkertaistumiseen (DNA-replikaatio) kahden tytärsolun tuottamiseksi.Soluissa, joissa on tuma, kuten eukaryooteissa, solusykli on myös jaettu kolmeen jaksoon: interfaasi, mitoottinen (M) vaihe ja sytokineesi.Propidiumjodidi (PI) on tumaa värjäävä väriaine, jota käytetään usein solusyklin mittaamiseen.Koska väriaine ei pääse eläviin soluihin, solut kiinnitetään etanolilla ennen värjäystä.Sitten kaikki solut värjätään.Jakautumiseen valmistautuvat solut sisältävät kasvavia määriä DNA:ta ja osoittavat suhteellisesti lisääntynyttä fluoresenssia.Fluoresenssin intensiteetin eroja käytetään solujen prosenttiosuuden määrittämiseen kussakin solusyklin vaiheessa.Countstar voi kaapata kuvan ja tulokset näytetään FCS Express -ohjelmistossa.(Kuva 2)
Kuvio 2: MCF-7 (A) ja 293T (B) värjättiin solusyklin havaitsemispakkauksella PI:llä, tulokset määritettiin Countstar Rigelillä ja analysoitiin FCS expressillä.
Elinkelpoisuuden ja GFP-transfektion määritys solussa
Bioprosessin aikana GFP:tä käytetään usein fuusioitumaan rekombinanttiproteiinin kanssa indikaattorina.Määritä GFP fluoresoiva voi heijastaa kohdeproteiinin ilmentymistä.Countstar Rigel tarjoaa nopean ja yksinkertaisen määrityksen GFP-transfektion ja elinkelpoisuuden testaamiseen.Solut värjättiin propidiumjodidilla (PI) ja Hoechst 33342:lla kuolleiden solujen populaation ja kokonaissolupopulaation määrittämiseksi.Countstar Rigel tarjoaa nopean, kvantitatiivisen menetelmän GFP-ilmentymisen tehokkuuden ja elinkelpoisuuden arvioimiseen samanaikaisesti.(Kuva 4)
Kuva 4: Solut paikannetaan käyttämällä Hoechst 33342:ta (sininen) ja GFP:tä ilmentävien solujen prosenttiosuus (vihreä) voidaan määrittää helposti.Elämättömät solut värjätään propidiumjodidilla (PI; punainen).
Elinkyky ja solujen määrä
AO/PI-kaksoisfluoresenssilaskenta on määritystyyppi, jota käytetään solupitoisuuden ja elinkelpoisuuden havaitsemiseen.Se jaettiin solulinjalaskentaan ja primäärisolulaskentaan eri solutyypin mukaan.Liuos sisältää yhdistelmän vihreää fluoresoivaa nukleiinihappoväriä, akridiinioranssia ja punaista fluoresoivaa nukleiinihappoväriä, propidiumjodidia.Propidiumjodidi on kalvon poissulkemisväri, joka pääsee vain soluihin, joiden kalvot ovat vahingoittuneet, kun taas akridiinioranssi tunkeutuu kaikkiin populaation soluihin.Kun molemmat värit ovat läsnä ytimessä, propidiumjodidi vähentää akridiinioranssin fluoresenssia fluoresenssiresonanssienergiansiirron (FRET) avulla.Tämän seurauksena tumalliset solut, joissa on ehjät kalvot, värjäytyvät fluoresoivasti vihreiksi ja lasketaan eläviksi, kun taas tumalliset solut, joiden kalvot ovat vahingoittuneet, värjäävät vain fluoresoivan punaisen ja ne lasketaan kuolleiksi käytettäessä Countstar Rigel -järjestelmää.Tumattomat materiaalit, kuten punasolut, verihiutaleet ja roskat, eivät fluoresoi, ja Countstar Rigel -ohjelmisto jättää ne huomiotta.(Kuva 5)
Kuva 5: Countstar on optimoinut kaksoisfluoresenssivärjäysmenetelmän PBMC-pitoisuuden ja elinkelpoisuuden yksinkertaista ja tarkkaa määritystä varten.AO/PI:llä värjätyt näytteet voidaan analysoida Countstar Rigelillä
