A análise dos leucócitos no sangue total é um ensaio de rotina em laboratório clínico ou banco de sangue.A concentração e viabilidade dos leucócitos são o índice vital como controle de qualidade do armazenamento de sangue.Além dos leucócitos, o sangue total contém um grande número de plaquetas, glóbulos vermelhos ou detritos celulares, o que torna impossível analisar o sangue total diretamente ao microscópio ou contador de células de campo claro.Os métodos convencionais para contar glóbulos brancos envolvem o processo de lise de RBC, que é demorado.
A contagem de fluorescência dupla AOPI é o tipo de ensaio usado para detectar a concentração e viabilidade das células.A solução é uma combinação de laranja de acridina (a coloração verde fluorescente de ácido nucleico) e iodeto de propídio (a coloração vermelha fluorescente de ácido nucleico).O iodeto de propídio (PI) é um corante de exclusão de membrana que entra apenas nas células com membranas comprometidas, enquanto o laranja de acridina é capaz de penetrar em todas as células de uma população.Quando ambos os corantes estão presentes no núcleo, o iodeto de propídio causa uma redução na fluorescência laranja de acridina por transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET).Como resultado, as células nucleadas com membranas intactas coram em verde fluorescente e são contadas como vivas, enquanto as células nucleadas com membranas comprometidas apenas coram em vermelho fluorescente e são contadas como mortas ao usar o sistema Countstar® Rigel.
Countstar Rigel é uma solução ideal para muitos ensaios complexos de caracterização de populações de células, permitindo analisar rapidamente glóbulos brancos em sangue total.
Procedimento experimental:
1.Recolha 20 µl de amostra de sangue e dilua a amostra em 180 µl de PBS.
2.Adicione 12µl de solução AO/PI em 12µl de amostra, misturando suavemente com a pipeta;
3.Desenhe 20µl da mistura na lâmina da câmara;
4. Deixe as células assentarem na câmara por cerca de 1 minuto;
5.Insect a lâmina no instrumento Countstar FL;
6. Escolha o ensaio “AO/PI Viability” e, em seguida, insira o ID da amostra para esta amostra.
7. Selecione Dilution ratio, Cell Type, e clique em 'Run' para iniciar o teste.
Atenção: AO e PI é um potencial cancerígeno.Recomenda-se que o operador use equipamento de proteção individual (EPI) para evitar o contato direto com a pele e os olhos.
Resultado:
1. Imagem de campo claro de sangue total
Na imagem de campo claro do sangue total, os glóbulos brancos não são visíveis entre os glóbulos vermelhos.(Figura 1)
Figura 1 Imagem de campo claro de sangue total.
2. Imagem de fluorescência de sangue total
O corante AO e PI são ambos corantes de DNA no núcleo celular das células.Portanto, plaquetas, glóbulos vermelhos ou restos celulares são incapazes de afetar a concentração de leucócitos e o resultado da viabilidade.Leucócitos vivos (verde) e leucócitos mortos (vermelho) são facilmente visualizados nas imagens de fluorescência.(Figura 2)
Figura 2 Imagens de fluorescência de sangue total.(UMA).Imagem do Canal AO;(B) Imagem do Canal PI;(C) Mesclar imagens de AO e PI Channel.
3. Concentração e viabilidade de leucócitos
O software Countstar FL conta automaticamente as células de três seções da câmara e calcula o valor médio da contagem total de células WBC (1202), concentração (1,83 x 106 células/ml) e % de viabilidade (82,04%).As imagens e dados de sangue total podem ser facilmente exportados como PDF, Imagem ou Excel para análise adicional ou arquivamento de dados.
Figura 3 Captura de tela do software Countstar Rigel
