A teljes vér leukocitáinak elemzése rutinvizsgálat a klinikai laboratóriumban vagy vérbankban.A leukociták koncentrációja és életképessége a létfontosságú mutató a vértárolás minőségellenőrzése szempontjából.A leukocitákon kívül a teljes vér nagyszámú vérlemezkét, vörösvértestet vagy sejttörmeléket tartalmaz, amelyek lehetetlenné teszik a teljes vér közvetlen mikroszkóp vagy fényerejű sejtszámláló alatti elemzését.A fehérvérsejtek megszámlálásának hagyományos módszerei a vörösvértestek lízisét foglalják magukban, ami időigényes.
Az AOPI kettős fluoreszcens számlálás a sejtkoncentráció és életképesség kimutatására használt vizsgálati típus.Az oldat az akridinnarancs (a zölden fluoreszkáló nukleinsav festés) és a propidium-jodid (a vörös fluoreszcens nukleinsav festés) kombinációja.A propidium-jodid (PI) egy membránkizáró festék, amely csak a sérült membránnal rendelkező sejtekbe jut be, míg az akridinnarancs képes behatolni a populáció összes sejtjébe.Ha mindkét színezék jelen van a sejtmagban, a propidium-jodid csökkenti az akridinnarancs fluoreszcenciáját a fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer (FRET) révén.Ennek eredményeként az ép membránnal rendelkező magos sejtek fluoreszkáló zöldre festődnek, és élőnek számítanak, míg a károsodott membránnal rendelkező magos sejtek csak fluoreszkáló vörösre festődnek, és a Countstar® Rigel rendszer használatakor elhaltnak számítanak.
A Countstar Rigel ideális megoldás számos komplex sejtpopuláció jellemzési vizsgálathoz, lehetővé téve a fehérvérsejtek gyors elemzését teljes vérben.
Kísérleti eljárás:
1. Vegyünk 20 µl vérmintát, és hígítsuk fel a mintát 180 µl PBS-ben.
2. Adjon 12 µl AO/PI oldatot 12 µl mintához, óvatosan keverje össze pipettával;
3. Húzzunk 20 µl keveréket a kamra tárgylemezére;
4. Hagyja, hogy a cellák körülbelül 1 percig leülepedjenek a kamrában;
5. Rovarozza be a tárgylemezt a Countstar FL műszerbe;
6. Válassza ki az „AO/PI Viability” assay-t, majd adja meg a minta azonosítóját.
7. Válassza ki a Hígítási arányt, a Cell Type elemet, majd kattintson a "Futtatás" gombra a teszt elindításához.
Figyelem: Az AO és a PI potenciálisan rákkeltő anyagok.Javasoljuk, hogy a kezelő személyi védőfelszerelést (PPE) viseljen, hogy elkerülje a bőrrel és szemmel való közvetlen érintkezést.
Eredmény:
1. Fényes mező Teljes vér képe
A teljes vér fényes mezőjében a fehérvérsejtek nem láthatók a vörösvértestek között.(1.ábra)
1. ábra Teljes vér világos mezős képe.
2. Fluoreszcencia Teljes vér képe
Az AO és a PI festék egyaránt megfesti a DNS-t a sejtek sejtmagjában.Ezért a vérlemezkék, a vörösvérsejtek vagy a sejttörmelékek nem képesek befolyásolni a leukociták koncentrációját és életképességét.Az élő leukociták (zöld) és az elhalt leukociták (piros) könnyen láthatóak a fluoreszcens képeken.(2. ábra)
2. ábra Fluoreszcencia képek a teljes vérről.(A).Az AO csatorna képe;(B) A PI-csatorna képe;(C) Az AO és a PI csatorna képeinek egyesítése.
3. A leukociták koncentrációja és életképessége
A Countstar FL szoftver automatikusan megszámolja három kamraszakasz sejtjeit, és kiszámítja a teljes WBC-sejtszám (1202), koncentráció (1,83 x 106 sejt/ml) és életképesség százalékos (82,04%) átlagos értékét.A teljes vérképek és adatok egyszerűen exportálhatók PDF, kép vagy Excel formátumban további elemzésekhez vagy adatok archiválásához.
3. ábra A Countstar Rigel Software képernyőképe
