Kokoveren leukosyyttien analysointi on rutiinimääritys kliinisessä laboratoriossa tai veripankissa.Leukosyyttien pitoisuus ja elinkelpoisuus ovat elintärkeä indeksi veren varastoinnin laadunvalvonnassa.Leukosyyttien lisäksi kokoveri sisältää suuren määrän verihiutaleita, punasoluja tai solujäämiä, mikä tekee mahdottomaksi analysoida kokoverta suoraan mikroskoopin tai kirkaskenttäsolulaskurin alla.Perinteiset menetelmät valkosolujen laskemiseksi sisältävät punasolujen hajoamisprosessin, joka on aikaa vievä.
AOPI Dual-fluoresces Counting on määritystyyppi, jota käytetään solupitoisuuden ja elinkelpoisuuden havaitsemiseen.Liuos on yhdistelmä akridiinioranssia (vihreästi fluoresoiva nukleiinihappoväri) ja propidiumjodidia (punaisena fluoresoiva nukleiinihappoväri).Propidiumjodidi (PI) on kalvosulkuväri, joka pääsee vain soluihin, joiden kalvot ovat vahingoittuneet, kun taas akridiinioranssi pystyy tunkeutumaan populaation kaikkiin soluihin.Kun molemmat värit ovat läsnä ytimessä, propidiumjodidi vähentää akridiinioranssin fluoresenssia fluoresenssiresonanssienergiansiirron (FRET) avulla.Tämän seurauksena tumalliset solut, joissa on ehjät kalvot, värjäytyvät fluoresoivasti vihreiksi ja lasketaan eläviksi, kun taas tumalliset solut, joiden kalvot ovat vahingoittuneet, värjäävät vain fluoresoivan punaisen, ja ne lasketaan kuolleiksi käytettäessä Countstar® Rigel -järjestelmää.
Countstar Rigel on ihanteellinen ratkaisu moniin monimutkaisiin solupopulaatioiden karakterisointimäärityksiin, jotka mahdollistavat valkoisten verisolujen nopean analysoinnin kokoverestä.
Kokeellinen menettely:
1.Ota 20 µl verinäytettä ja laimenna näyte 180 µl:lla PBS:ää.
2. Lisää 12 µl AO/PI-liuosta 12 µl:aan näytettä varovasti pipetillä sekoitettuna;
3. Vedä 20 µl seosta kammiolevylle;
4.Anna solujen asettua kammioon noin 1 minuutin ajan;
5.Pidä objektilasi Countstar FL -instrumenttiin;
6.Valitse "AO/PI Viability" -määritys ja anna tämän näytteen näytteen tunnus.
7. Valitse Laimennussuhde, Cell Type ja napsauta "Run" aloittaaksesi testi.
Varoitus: AO ja PI ovat potentiaalisia karsinogeeneja.On suositeltavaa, että käyttäjä käyttää henkilökohtaisia suojavarusteita (PPE), jotta vältetään suora kosketus iholle ja silmiin.
Tulos:
1. Kirkas kenttä Kokoveren kuva
Kokoveren kirkkaassa kenttäkuvassa valkosolut eivät näy punasolujen joukossa.(Kuvio 1)
Kuva 1 Kirkas kenttäkuva kokoverestä.
2. Fluoresenssikuva kokoverestä
AO- ja PI-väriaine ovat molemmat värjäys-DNA:ta solujen ytimessä.Siksi verihiutaleet, punasolut tai solujätteet eivät pysty vaikuttamaan leukosyyttien pitoisuuteen ja elinkelpoisuuteen.Elävät leukosyytit (vihreä) ja kuolleet leukosyytit (punainen) näkyvät helposti fluoresenssikuvissa.(Kuva 2)
Kuva 2 Fluoresenssikuvat kokoverestä.(A).Kuva AO-kanavasta;(B) PI-kanavan kuva;(C) Yhdistä AO- ja PI-kanavan kuvat.
3. Leukosyyttien pitoisuus ja elinkelpoisuus
Countstar FL -ohjelmisto laskee automaattisesti kolmen kammioosan solut ja laskee valkosolujen kokonaismäärän (1202), konsentraation (1,83 x 106 solua/ml) ja elinkelpoisuuden prosentin (82,04 %) keskiarvon.Kokoverikuvat ja -tiedot voidaan helposti viedä PDF-, kuva- tai Excel-muodossa lisäanalyysiä tai tietojen arkistointia varten.
Kuva 3 Kuvakaappaus Countstar Rigel -ohjelmistosta
