Analyse af leukocytter i fuldblod er en rutineanalyse i klinisk laboratorium eller blodbank.Koncentrationen og levedygtigheden af leukocytterne er det vitale indeks som kvalitetskontrol af blodopbevaring.Udover leukocytter indeholder fuldblod et stort antal blodplader, røde blodlegemer eller celleaffald, som gør det umuligt at analysere fuldblod direkte under mikroskopet eller lysfeltcelletælleren.Konventionelle metoder til at tælle hvide blodlegemer involverer RBC-lyseprocessen, som er tidskrævende.
AOPI Dual-fluoresces-tælling er den analysetype, der bruges til at detektere cellekoncentration og levedygtighed.Opløsningen er en kombination af acridinorange (den grøn-fluorescerende nukleinsyrefarve) og propidiumiodid (den rød-fluorescerende nukleinsyrefarve).Propidiumiodid (PI) er et membranudelukkende farvestof, der kun trænger ind i celler med kompromitterede membraner, mens acridin orange er i stand til at trænge ind i alle celler i en population.Når begge farvestoffer er til stede i kernen, forårsager propidiumiodid en reduktion i acridinorange fluorescens ved fluorescensresonansenergioverførsel (FRET).Som et resultat heraf farves nukleerede celler med intakte membraner fluorescerende grønne og tælles som levende, hvorimod nukleerede celler med kompromitterede membraner kun farves fluorescerende røde og tælles som døde, når Countstar® Rigel-systemet bruges.
Countstar Rigel er en ideel løsning til mange komplekse cellepopulationskarakteriseringsassays, der gør det muligt hurtigt at analysere hvide blodlegemer i fuldblod.
Eksperimentel procedure:
1. Tag 20 µl blodprøve og fortynd prøven i 180 µl PBS.
2. Tilsæt 12 µl AO/PI-opløsning til 12 µl prøve, forsigtigt blandet med pipette;
3. Træk 20 µl blanding ind i kammerobjektglasset;
4. Lad cellerne sætte sig i kammeret i ca. 1 minut;
5. Insektion af objektglasset i Countstar FL-instrumentet;
6.Vælg "AO/PI Viability"-analysen, og indtast derefter prøve-id for denne prøve.
7.Vælg Fortyndingsforhold, Celletype, klik på 'Kør' for at starte testen.
Forsigtig: AO og PI er et potentielt kræftfremkaldende stof.Det anbefales, at operatøren bærer personlige værnemidler (PPE) for at undgå direkte kontakt med hud og øjne.
Resultat:
1. Bright Field Billede af fuldblod
I det lyse feltbillede af fuldblodet er WBC'er ikke synlige blandt de røde blodlegemer.(Figur 1)
Figur 1 Lysfeltbillede af fuldblod.
2. Fluorescensbillede af fuldblod
AO- og PI-farvestoffet er begge farver DNA i cellekernen af celler.Derfor er blodplader, røde blodlegemer eller celleaffald ikke i stand til at påvirke leukocytkoncentrationen og levedygtighedsresultatet.Levende leukocytter (grøn) og døde leukocytter (rød) visualiseres let i fluorescensbillederne.(Figur 2)
Figur 2 Fluorescensbilleder af fuldblod.(EN).Billede af AO Channel;(B) Billede af PI-kanal;(C) Flet billeder af AO og PI Channel.
3. Koncentration og levedygtighed af leukocytter
Countstar FL-softwaren tæller automatisk celler i tre kammersektioner og beregner gennemsnitsværdien af det samlede antal WBC-celler (1202), koncentration (1,83 x 106 celler/ml) og % levedygtighed (82,04%).Fuldblodsbillederne og -dataene kan nemt eksporteres som PDF, Billede eller Excel til yderligere analyse eller dataarkivering.
Figur 3 Skærmbillede af Countstar Rigel Software
