A análise dos leucocitos en sangue enteiro é un ensaio de rutina no laboratorio clínico ou no banco de sangue.A concentración e viabilidade dos leucocitos son o índice vital como control de calidade do almacenamento de sangue.Ademais dos leucocitos, o sangue enteiro contén unha gran cantidade de plaquetas, glóbulos vermellos ou restos celulares, que fan imposible analizar o sangue enteiro directamente ao microscopio ou ao contador de células de campo brillante.Os métodos convencionais para contar glóbulos brancos implican un proceso de lise de glóbulos rojos, que leva moito tempo.
O reconto de fluorescencia dual AOPI é o tipo de ensaio utilizado para detectar a concentración e viabilidade celular.A solución é unha combinación de laranxa de acridina (a mancha de ácido nucleico fluorescente verde) e ioduro de propidio (a tinción de ácido nucleico fluorescente vermello).O ioduro de propidio (PI) é un colorante de exclusión de membrana que só entra nas células con membranas comprometidas, mentres que a laranxa de acridina é capaz de penetrar en todas as células dunha poboación.Cando ambos os colorantes están presentes no núcleo, o ioduro de propidio provoca unha redución da fluorescencia de laranxa de acridina pola transferencia de enerxía de resonancia da fluorescencia (FRET).Como resultado, as células nucleadas con membranas intactas téñense de verde fluorescente e cóntanse como vivas, mentres que as células nucleadas con membranas comprometidas só manchan de vermello fluorescente e cóntanse como mortas cando se usa o sistema Countstar® Rigel.
Countstar Rigel é unha solución ideal para moitos ensaios de caracterización de poboacións celulares complexas, que permiten analizar rapidamente os glóbulos brancos en sangue enteiro.
Procedemento experimental:
1.Toma 20 µl de mostra de sangue e dilúe a mostra en 180 µl de PBS.
2.Engade 12 µl de solución AO/PI a 12 µl de mostra, mesturando suavemente coa pipeta;
3.Draw 20µl de mestura no portaobjetos da cámara;
4.Deixa que as células se asenten na cámara durante aproximadamente 1 minuto;
5.Insecte o portaobjetos no instrumento Countstar FL;
6.Escolla o ensaio "Viabilidade AO/PI" e, a continuación, introduza o ID da mostra para esta mostra.
7.Seleccione Proporción de dilución, Tipo de cela, prema en "Executar" para iniciar a proba.
Precaución: AO e PI son un potencial canceríxeno.Recoméndase que o operador use equipo de protección individual (EPI) para evitar o contacto directo coa pel e os ollos.
Resultado:
1. Imaxe de campo brillante de sangue enteiro
Na imaxe de campo brillante de todo o sangue, os leucocitos non son visibles entre os glóbulos vermellos.(Figura 1)
Figura 1 Imaxe de campo brillante de sangue enteiro.
2. Fluorescencia Imaxe de sangue enteiro
O colorante AO e PI son ambas as tincións de ADN no núcleo celular das células.Polo tanto, as plaquetas, os glóbulos vermellos ou os restos celulares non poden afectar a concentración e a viabilidade dos leucocitos.Os leucocitos vivos (verde) e os leucocitos mortos (vermello) visualízanse facilmente nas imaxes de fluorescencia.(Figura 2)
Figura 2 Imaxes de fluorescencia de sangue enteiro.(A).Imaxe da canle AO;(B) Imaxe de PI Channel;(C) Combina imaxes de AO e PI Channel.
3. Concentración e viabilidade dos leucocitos
O software Countstar FL conta automaticamente as células de tres seccións de cámara e calcula o valor medio do reconto total de células WBC (1202), a concentración (1,83 x 106 células/ml) e o % de viabilidade (82,04%).As imaxes e os datos de sangue enteiro pódense exportar facilmente como PDF, Imaxe ou Excel para unha análise adicional ou o arquivo de datos.
Figura 3 Captura de pantalla do software Countstar Rigel
