Анализ лейкоцитов в цельной крови является рутинным анализом в клинической лаборатории или банке крови.Концентрация и жизнеспособность лейкоцитов являются жизненным показателем как контроль качества хранения крови.Помимо лейкоцитов, цельная кровь содержит большое количество тромбоцитов, эритроцитов или клеточного дебриса, что делает невозможным анализ цельной крови непосредственно под микроскопом или счетчиком клеток со светлым полем.Обычные методы подсчета лейкоцитов включают процесс лизиса эритроцитов, который занимает много времени.
Двойной флуоресцентный подсчет AOPI — это тип анализа, используемый для определения концентрации и жизнеспособности клеток.Решение представляет собой комбинацию акридинового оранжевого (зеленая флуоресцентная окраска нуклеиновой кислоты) и йодида пропидия (красная флуоресцентная окраска нуклеиновой кислоты).Йодид пропидия (PI) представляет собой краситель для исключения мембран, который проникает только в клетки с поврежденными мембранами, в то время как акридиновый оранжевый способен проникать во все клетки в популяции.Когда в ядре присутствуют оба красителя, йодид пропидия вызывает снижение флуоресценции акридинового оранжевого за счет резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).В результате ядросодержащие клетки с неповрежденными мембранами окрашиваются флуоресцентно-зеленым цветом и считаются живыми, тогда как ядросодержащие клетки с поврежденными мембранами окрашиваются только флуоресцентно-красным цветом и считаются мертвыми при использовании системы Rigel.
Countstar Rigel — идеальное решение для многих сложных анализов характеристик клеточных популяций, позволяющее быстро анализировать лейкоциты в цельной крови.
Экспериментальная процедура:
1. Возьмите 20 мкл образца крови и разведите образец в 180 мкл PBS.
2. Добавьте 12 мкл раствора AO/PI в 12 мкл образца, аккуратно перемешайте пипеткой;
3. Наберите 20 мкл смеси на предметное стекло;
4. Дайте клеткам осесть в камере примерно на 1 минуту;
5. Вставьте предметное стекло в Countstar FL;
6. Выберите анализ «AO/PI Viability», затем введите идентификатор образца для этого образца.
7. Выберите «Коэффициент разбавления», «Тип ячейки», нажмите «Выполнить», чтобы начать тест.
Предупреждение: АО и ПИ являются потенциальным канцерогеном.Оператору рекомендуется носить средства индивидуальной защиты (СИЗ) во избежание прямого контакта с кожей и глазами.
Результат:
1. Изображение цельной крови в светлом поле
На светлопольном изображении цельной крови лейкоциты не видны среди эритроцитов.(Фигура 1)
Рис. 1. Изображение цельной крови в светлом поле.
2. Флуоресцентное изображение цельной крови
Оба красителя АО и PI окрашивают ДНК в клеточном ядре клеток.Таким образом, тромбоциты, эритроциты или клеточный мусор не могут повлиять на концентрацию лейкоцитов и их жизнеспособность.Живые лейкоциты (зеленый) и мертвые лейкоциты (красный) легко визуализируются на флуоресцентных изображениях.(Фигура 2)
Рисунок 2. Флуоресцентные изображения цельной крови.(А).Изображение канала АО;(B) Изображение канала PI;(C) объединить изображения AO и PI Channel.
3. Концентрация и жизнеспособность лейкоцитов
Программное обеспечение FL автоматически подсчитывает клетки в трех секциях камеры и рассчитывает среднее значение общего количества клеток WBC (1202), концентрацию (1,83 x 106 клеток/мл) и % жизнеспособности (82,04%).Изображения и данные цельной крови можно легко экспортировать в формате PDF, Image или Excel для дополнительного анализа или архивирования данных.
Рис. 3. Снимок экрана программного обеспечения Countstar Rigel
