El análisis de los leucocitos en sangre total es un ensayo de rutina en el laboratorio clínico o banco de sangre.La concentración y viabilidad de los leucocitos son el índice vital como control de calidad del almacenamiento de sangre.Aparte de los leucocitos, la sangre completa contiene una gran cantidad de plaquetas, glóbulos rojos o desechos celulares, lo que hace imposible analizar la sangre completa directamente bajo el microscopio o el contador de células de campo claro.Los métodos convencionales para contar glóbulos blancos implican un proceso de lisis de glóbulos rojos, que lleva mucho tiempo.
El recuento de fluorescencia dual de AOPI es el tipo de ensayo utilizado para detectar la concentración y la viabilidad de las células.La solución es una combinación de naranja de acridina (la tinción de ácido nucleico verde fluorescente) y yoduro de propidio (la tinción de ácido nucleico rojo fluorescente).El yoduro de propidio (PI) es un tinte de exclusión de membrana que solo ingresa a las células con membranas comprometidas, mientras que el naranja de acridina puede penetrar en todas las células de una población.Cuando ambos colorantes están presentes en el núcleo, el yoduro de propidio provoca una reducción de la fluorescencia naranja de acridina por transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET).Como resultado, las células nucleadas con membranas intactas se tiñen de verde fluorescente y se cuentan como vivas, mientras que las células nucleadas con membranas comprometidas solo se tiñen de rojo fluorescente y se cuentan como muertas cuando se utiliza el sistema ® Rigel.
Countstar Rigel es una solución ideal para muchos ensayos complejos de caracterización de poblaciones celulares, que permite analizar rápidamente los glóbulos blancos en sangre total.
Procedimiento experimental:
1.Tome 20 µl de muestra de sangre y diluya la muestra en 180 µl de PBS.
2. Agregue 12 µl de solución de AO/PI a 12 µl de muestra, mezcle suavemente con una pipeta;
3. Extraiga 20 µl de la mezcla en el portaobjetos de la cámara;
4. Permita que las células se asienten en la cámara durante aproximadamente 1 minuto;
5. Inserte el portaobjetos en el instrumento Countstar FL;
6. Elija el ensayo “Viabilidad AO/PI”, luego ingrese el ID de muestra para esta muestra.
7.Seleccione la relación de dilución, el tipo de celda y haga clic en 'Ejecutar' para iniciar la prueba.
Precaución: AO y PI son carcinógenos potenciales.Se recomienda que el operador use equipo de protección personal (EPP) para evitar el contacto directo con la piel y los ojos.
Resultado:
1. Imagen de campo brillante de sangre completa
En la imagen de campo brillante de la sangre entera, los glóbulos blancos no son visibles entre los glóbulos rojos.(Figura 1)
Figura 1 Imagen de campo claro de sangre completa.
2. Imagen de fluorescencia de sangre entera
Los colorantes AO y PI tiñen el ADN en el núcleo celular de las células.Por lo tanto, las plaquetas, los glóbulos rojos o los desechos celulares no pueden afectar la concentración de leucocitos y el resultado de viabilidad.Los leucocitos vivos (verde) y los leucocitos muertos (rojo) se visualizan fácilmente en las imágenes de fluorescencia.(Figura 2)
Figura 2 Imágenes de fluorescencia de sangre entera.(A).Imagen del Canal AO;(B) Imagen del canal PI;(C) Combinar imágenes de AO y PI Channel.
3. Concentración y viabilidad de leucocitos
El software FL cuenta automáticamente las células de tres secciones de cámara y calcula el valor medio del recuento total de células WBC (1202), la concentración (1,83 x 106 células/ml) y el % de viabilidad (82,04%).Las imágenes y los datos de sangre completa se pueden exportar fácilmente como PDF, imagen o Excel para análisis adicionales o archivado de datos.
Figura 3 Captura de pantalla del software Countstar Rigel
