Menganalisis leukosit dalam darah keseluruhan adalah ujian rutin di makmal klinikal atau bank darah.Kepekatan dan daya maju leukosit adalah indeks penting sebagai kawalan kualiti penyimpanan darah.Selain daripada leukosit, seluruh darah mengandungi sejumlah besar platelet, sel darah merah, atau serpihan selular, yang menjadikannya mustahil untuk menganalisis darah keseluruhan secara langsung di bawah mikroskop atau kaunter sel medan terang.Kaedah konvensional untuk mengira sel darah putih melibatkan proses lisis RBC, yang memakan masa.
Pengiraan Dwi-pendarfluor AOPI ialah jenis ujian yang digunakan untuk mengesan kepekatan dan daya maju sel.Penyelesaiannya ialah gabungan oren acridine (noda asid nukleik pendarfluor hijau) dan propidium iodida (noda asid nukleik pendarfluor merah).Propidium iodide (PI) ialah pewarna pengecualian membran yang hanya memasuki sel dengan membran yang terjejas, manakala oren acridine mampu menembusi semua sel dalam populasi.Apabila kedua-dua pewarna terdapat dalam nukleus, propidium iodide menyebabkan pengurangan dalam pendarfluor oren acridine oleh pemindahan tenaga resonans pendarfluor (FRET).Akibatnya, sel bernukleus dengan membran utuh mengotorkan hijau pendarfluor dan dikira sebagai hidup, manakala sel bernukleus dengan membran terjejas hanya mengotorkan merah pendarfluor dan dikira sebagai mati apabila menggunakan sistem Countstar® Rigel.
Countstar Rigel ialah penyelesaian ideal untuk banyak ujian pencirian populasi sel yang kompleks, membolehkan untuk menganalisis sel darah putih dengan cepat dalam darah keseluruhan.
Prosedur Eksperimen:
1. Ambil 20 µl sampel darah dan cairkan sampel dalam 180 µl PBS.
2. Tambahkan 12µl larutan AO/PI ke dalam sampel 12µl, dicampur perlahan-lahan dengan pipet;
3. Lukiskan campuran 20µl ke dalam slaid ruang;
4. Benarkan sel-sel untuk menetap di dalam ruang selama kira-kira 1 minit;
5. Serangga slaid ke dalam instrumen Countstar FL;
6. Pilih ujian "AO/PI Viability", kemudian Masukkan ID Sampel untuk sampel ini.
7.Pilih Nisbah Pencairan, Jenis Sel, klik 'Jalankan' untuk memulakan ujian.
Awas: AO dan PI adalah karsinogen yang berpotensi.Adalah disyorkan agar pengendali memakai peralatan pelindung diri (PPE) untuk mengelakkan sentuhan terus dengan kulit dan mata.
Keputusan:
1. Imej Medan Cerah darah keseluruhan
Dalam imej medan terang seluruh darah, WBC tidak kelihatan di kalangan sel darah merah.(Rajah 1)
Rajah 1 Imej medan terang bagi seluruh darah.
2. Pendarfluor Imej darah keseluruhan
Pewarna AO dan PI adalah pewarna DNA dalam nukleus sel sel.Oleh itu, Platelet, sel darah merah, atau serpihan selular tidak dapat menjejaskan kepekatan leukosit dan hasil daya maju.Leukosit hidup (Hijau) dan leukosit mati (Merah) mudah digambarkan dalam imej pendarfluor.(Rajah 2)
Rajah 2 Imej Pendarfluor bagi seluruh darah.(A).Imej Saluran AO;(B) Imej Saluran PI;(C) Gabungkan imej Saluran AO dan PI.
3. Kepekatan dan daya maju leukosit
Perisian Countstar FL secara automatik mengira sel bagi tiga bahagian ruang dan mengira nilai purata jumlah kiraan sel WBC (1202), kepekatan (1.83 x 106 sel/ml) dan % daya maju (82.04%).Imej dan data keseluruhan darah boleh dieksport dengan mudah sebagai PDF, Imej atau Excel untuk analisis tambahan atau pengarkiban data.
Rajah 3 Petikan Skrin Perisian Countstar Rigel
