Analiza leukocita u punoj krvi rutinski je test u kliničkoj laboratoriji ili banci krvi.Koncentracija i održivost leukocita su vitalni indeks kontrole kvaliteta skladištenja krvi.Osim leukocita, puna krv sadrži veliki broj trombocita, crvenih krvnih zrnaca ili ćelijskih ostataka, što onemogućuje analizu pune krvi direktno pod mikroskopom ili brojačem ćelija svijetlog polja.Konvencionalne metode za brojanje bijelih krvnih zrnaca uključuju proces lize eritrocita, koji je dugotrajan.
AOPI Dual-fluorescent counting je tip testa koji se koristi za otkrivanje koncentracije i vitalnosti ćelija.Rješenje je kombinacija akridin narandže (zeleno-fluorescentna boja nukleinske kiseline) i propidijum jodida (crvena fluorescentna boja nukleinske kiseline).Propidijum jodid (PI) je membranska ekskluziona boja koja ulazi samo u ćelije sa ugroženim membranama, dok akridin narandžasta može da prodre u sve ćelije u populaciji.Kada su obe boje prisutne u jezgru, propidijum jodid uzrokuje smanjenje akridin narandžaste fluorescencije putem fluorescentnog rezonantnog prenosa energije (FRET).Kao rezultat toga, ćelije sa jezgrom sa netaknutim membranama boje se fluorescentno zelenom bojom i računaju se kao žive, dok ćelije sa jezgrom sa ugroženim membranama boje samo fluorescentno crveno i računaju se kao mrtve kada se koristi Countstar® Rigel sistem.
Countstar Rigel je idealno rješenje za mnoge složene testove karakterizacije stanične populacije, omogućavajući brzu analizu bijelih krvnih stanica u punoj krvi.
Eksperimentalni postupak:
1. Uzmite 20 µl uzorka krvi i razrijedite uzorak u 180 µl PBS-a.
2.Dodajte 12 µl AO/PI rastvora u 12 µl uzorka, lagano pomešajte pipetom;
3. Uvucite 20 µl smjese u staklo komore;
4. Dozvolite ćelijama da se talože u komori oko 1 minut;
5. Insektirajte klizač u instrument Countstar FL;
6.Odaberite test “AO/PI Viability”, a zatim Unesite ID uzorka za ovaj uzorak.
7. Izaberite Omjer razblaženja, Tip ćelije, kliknite na 'Run' da započnete test.
Oprez: AO i PI su potencijalni kancerogen.Preporučuje se da operater nosi ličnu zaštitnu opremu (PPE) kako bi izbjegao direktan kontakt s kožom i očima.
rezultat:
1. Bright Field Slika pune krvi
Na slici u svijetlom polju pune krvi, WBC nisu vidljivi među crvenim krvnim zrncima.(Slika 1)
Slika 1. Slika pune krvi u svijetlom polju.
2. Fluorescentna slika pune krvi
AO i PI boja obojene su DNK u ćelijskom jezgru ćelija.Stoga, trombociti, crvena krvna zrnca ili ćelijski ostaci ne mogu utjecati na koncentraciju leukocita i rezultat vitalnosti.Živi leukociti (zeleni) i mrtvi leukociti (crveni) se lako vizualiziraju na fluorescentnim slikama.(Slika 2)
Slika 2 Fluorescentne slike pune krvi.(A).Slika AO kanala;(B) Slika PI kanala;(C) Spojite slike AO i PI kanala.
3. Koncentracija i održivost leukocita
Countstar FL softver automatski broji ćelije tri komorne sekcije i izračunava prosječnu vrijednost ukupnog broja WBC ćelija (1202), koncentracije (1,83 x 106 ćelija/ml) i % vitalnosti (82,04%).Slike i podaci pune krvi mogu se lako izvesti kao PDF, Image ili Excel za dodatnu analizu ili arhiviranje podataka.
Slika 3 Snimak ekrana softvera Countstar Rigel
