Analiza leucocitelor din sângele integral este un test de rutină în laboratorul clinic sau banca de sânge.Concentrația și viabilitatea leucocitelor reprezintă indicele vital ca control al calității stocării sângelui.În afară de leucocite, sângele integral conține un număr mare de trombocite, globule roșii sau resturi celulare, ceea ce face imposibilă analizarea sângelui integral direct la microscop sau la contorul de celule în câmp luminos.Metodele convenționale de numărare a globulelor albe implică un proces de liză a RBC, care necesită timp.
Numărarea cu fluorescență duală AOPI este tipul de analiză utilizat pentru detectarea concentrației și viabilității celulelor.Soluția este o combinație de portocaliu de acridină (colorația verde-fluorescentă a acidului nucleic) și iodură de propidiu (colorația roșie-fluorescentă a acidului nucleic).Iodura de propidiu (PI) este un colorant de excludere a membranei care intră numai în celulele cu membrane compromise, în timp ce portocaliul de acridină este capabil să pătrundă în toate celulele dintr-o populație.Când ambii coloranți sunt prezenți în nucleu, iodura de propidiu determină o reducere a fluorescenței portocalii de acridină prin transferul de energie prin rezonanță fluorescentă (FRET).Ca rezultat, celulele nucleate cu membrane intacte colorează verde fluorescent și sunt numărate ca fiind vii, în timp ce celulele nucleate cu membrane compromise colorează doar roșu fluorescent și sunt numărate ca moarte când se utilizează sistemul Countstar® Rigel.
Countstar Rigel este o soluție ideală pentru multe teste complexe de caracterizare a populației de celule, care permit analizarea rapidă a globulelor albe din sângele integral.
Procedura experimentala:
1. Se iau 20 µl de probă de sânge și se diluează proba în 180 µl de PBS.
2. Adăugați 12 µl de soluție AO/PI într-o probă de 12 µl, amestecată ușor cu pipeta;
3.Atrageți 20µl amestec în lama camerei;
4. Lăsați celulele să se așeze în cameră timp de aproximativ 1 minut;
5.Insectați diapozitivul în instrumentul Countstar FL;
6.Alegeți testul „Viabilitate AO/PI”, apoi introduceți ID-ul probei pentru această probă.
7.Selectați Raportul de diluare, Tipul celulei, faceți clic pe „Run” pentru a începe testul.
Atenție: AO și PI sunt un potențial cancerigen.Se recomandă ca operatorul să poarte echipament individual de protecție (EIP) pentru a evita contactul direct cu pielea și ochii.
Rezultat:
1. Bright Field Imagine a sângelui integral
În imaginea în câmp luminos a întregului sânge, leucocite nu sunt vizibile printre celulele roșii din sânge.(Figura 1)
Figura 1 Imagine în câmp luminos a sângelui integral.
2. Imagine de fluorescență a sângelui integral
Colorantul AO și PI sunt ambele colorante de ADN din nucleul celular al celulelor.Prin urmare, trombocitele, globulele roșii sau resturile celulare nu pot afecta concentrația leucocitelor și rezultatul viabilității.Leucocitele vii (verde) și leucocitele moarte (roșu) sunt ușor de vizualizat în imaginile cu fluorescență.(Figura 2)
Figura 2 Imagini de fluorescență ale sângelui integral.(A).Imagine a canalului AO;(B) Imaginea canalului PI;(C) Îmbinați imaginile AO și PI Channel.
3. Concentrația și viabilitatea leucocitelor
Software-ul Countstar FL numără automat celulele din trei secțiuni de camere și calculează valoarea medie a numărului total de celule WBC (1202), concentrația (1,83 x 106 celule/ml) și % viabilitate (82,04%).Imaginile și datele de sânge integral pot fi exportate cu ușurință ca PDF, Image sau Excel pentru analize suplimentare sau arhivare a datelor.
Figura 3 Captură de ecran a software-ului Countstar Rigel
