Analyse av leukocytter i fullblod er en rutineanalyse i klinisk laboratorium eller blodbank.Konsentrasjonen og levedyktigheten til leukocyttene er den vitale indeksen som kvalitetskontroll av blodlagring.Bortsett fra leukocytter inneholder helblod et stort antall blodplater, røde blodceller eller celleavfall, som gjør det umulig å analysere fullblod direkte under mikroskopet eller lysfeltcelletelleren.Konvensjonelle metoder for å telle hvite blodceller involverer RBC-lyseprosessen, som er tidkrevende.
AOPI Dual-fluoresces-telling er analysetypen som brukes for å oppdage cellekonsentrasjon og levedyktighet.Løsningen er en kombinasjon av akridinoransje (den grønnfluorescerende nukleinsyreflekken) og propidiumjodid (den rødfluorescerende nukleinsyreflekken).Propidiumjodid (PI) er et membraneksklusjonsfargestoff som bare kommer inn i celler med kompromitterte membraner, mens akridinoransje er i stand til å penetrere alle celler i en populasjon.Når begge fargestoffene er tilstede i kjernen, forårsaker propidiumjodid en reduksjon i akridinoransjefluorescens ved fluorescensresonansenergioverføring (FRET).Som et resultat av dette farges kjerneholdige celler med intakte membraner fluorescerende grønt og regnes som levende, mens kjerneholdige celler med kompromitterte membraner bare farges fluorescerende rødt og regnes som døde ved bruk av Countstar® Rigel-systemet.
Countstar Rigel er en ideell løsning for mange komplekse cellepopulasjonskarakteriseringsanalyser, som gjør det mulig å raskt analysere hvite blodceller i fullblod.
Eksperimentell prosedyre:
1.Ta 20 µl blodprøve og fortynn prøven i 180 µl PBS.
2. Tilsett 12 µl AO/PI-løsning i 12 µl prøve, forsiktig blandet med pipette;
3. Trekk 20 µl blanding inn i kammerglasset;
4. La cellene sette seg i kammeret i ca. 1 minutt;
5. Insekter lysbildet i Countstar FL-instrumentet;
6.Velg "AO/PI Viability"-analysen, og skriv deretter inn prøve-ID for denne prøven.
7.Velg Fortynningsforhold, Celletype, klikk "Kjør" for å starte testen.
Forsiktig: AO og PI er potensielt kreftfremkallende.Det anbefales at operatøren bruker personlig verneutstyr (PPE) for å unngå direkte kontakt med hud og øyne.
Resultat:
1. Bright Field Bilde av fullblod
I det lyse feltbildet av helblodet er ikke hvite blodlegemer synlige blant de røde blodcellene.(Figur 1)
Figur 1 Lysfeltbilde av fullblod.
2. Fluorescensbilde av fullblod
AO- og PI-fargestoffet er begge flekker DNA i cellekjernen til celler.Derfor kan ikke blodplater, røde blodlegemer eller celleavfall påvirke leukocyttkonsentrasjonen og levedyktighetsresultatet.Levende leukocytter (grønn) og døde leukocytter (rød) visualiseres lett i fluorescensbildene.(Figur 2)
Figur 2 Fluorescensbilder av fullblod.(EN).Bilde av AO Channel;(B) Bilde av PI-kanal;(C) Slå sammen bilder av AO og PI Channel.
3. Konsentrasjon og levedyktighet av leukocytter
Countstar FL-programvaren teller automatisk celler i tre kammerseksjoner og beregner gjennomsnittsverdien av totalt antall WBC-celler (1202), konsentrasjon (1,83 x 106 celler/ml) og % levedyktighet (82,04 %).Fullblodsbildene og dataene kan enkelt eksporteres som PDF, bilde eller Excel for ytterligere analyse eller dataarkivering.
Figur 3 Skjermbilde av Countstar Rigel-programvaren
