Menganalisis leukosit dalam darah lengkap adalah tes rutin di laboratorium klinis atau bank darah.Konsentrasi dan viabilitas leukosit merupakan indeks vital sebagai kontrol kualitas penyimpanan darah.Selain leukosit, darah lengkap mengandung sejumlah besar trombosit, sel darah merah, atau puing-puing seluler, yang membuat tidak mungkin untuk menganalisis seluruh darah secara langsung di bawah mikroskop atau penghitung sel medan terang.Metode konvensional untuk menghitung sel darah putih melibatkan proses lisis RBC, yang memakan waktu.
Penghitungan fluoresensi ganda AOPI adalah jenis pengujian yang digunakan untuk mendeteksi konsentrasi dan viabilitas sel.Solusinya adalah kombinasi acridine orange (pewarnaan asam nukleat fluoresen hijau) dan propidium iodida (pewarnaan asam nukleat fluoresen merah).Propidium iodide (PI) adalah pewarna eksklusi membran yang hanya memasuki sel dengan membran terganggu, sedangkan acridine orange mampu menembus semua sel dalam suatu populasi.Ketika kedua pewarna hadir dalam nukleus, propidium iodida menyebabkan pengurangan fluoresensi jingga acridine oleh transfer energi resonansi fluoresensi (FRET).Akibatnya, sel berinti dengan membran utuh menodai hijau fluoresen dan dihitung sebagai hidup, sedangkan sel berinti dengan membran terganggu hanya menodai merah fluoresen dan dihitung mati saat menggunakan sistem Countstar® Rigel.
Countstar Rigel adalah solusi ideal untuk banyak tes karakterisasi populasi sel yang kompleks, memungkinkan untuk menganalisis sel darah putih dengan cepat dalam darah lengkap.
Prosedur percobaan:
1.Ambil 20 l sampel darah dan encerkan sampel dalam 180 l PBS.
2. Tambahkan larutan AO/PI 12µl ke dalam sampel 12µl, aduk perlahan dengan pipet;
3.Draw 20µl campuran ke dalam ruang slide;
4.Biarkan sel mengendap di dalam ruangan selama sekitar 1 menit;
5. Serangkai slide ke instrumen Countstar FL;
6.Pilih uji “Kelangsungan AO/PI”, lalu Masukkan ID Sampel untuk sampel ini.
7.Pilih Dilution ratio, Cell Type, klik 'Run' untuk memulai tes.
Perhatian: AO dan PI adalah karsinogen potensial.Disarankan agar operator memakai alat pelindung diri (APD) untuk menghindari kontak langsung dengan kulit dan mata.
Hasil:
1. Gambar Medan Cerah dari darah utuh
Dalam gambar bidang terang dari seluruh darah, WBC tidak terlihat di antara sel darah merah.(Gambar 1)
Gambar 1 Gambar bidang terang darah lengkap.
2. Gambar Fluoresensi darah utuh
Pewarna AO dan PI keduanya mewarnai DNA dalam inti sel sel.Oleh karena itu, Trombosit, sel darah merah, atau debris seluler tidak dapat mempengaruhi konsentrasi dan hasil viabilitas leukosit.Leukosit hidup (Hijau) dan leukosit mati (Merah) mudah divisualisasikan dalam gambar fluoresensi.(Gambar 2)
Gambar 2 Gambar Fluoresensi darah lengkap.(SEBUAH).Gambar Saluran AO;(B) Gambar Saluran PI;(C) Menggabungkan gambar Saluran AO dan PI.
3. Konsentrasi dan viabilitas leukosit
Perangkat lunak Countstar FL secara otomatis menghitung sel dari tiga bagian ruang dan menghitung nilai rata-rata jumlah sel WBC total (1202), konsentrasi (1,83 x 106 sel/ml), dan % viabilitas (82,04%).Seluruh gambar dan data darah dapat dengan mudah diekspor sebagai PDF, Gambar atau Excel untuk analisis tambahan atau pengarsipan data.
Gambar 3 Tangkapan Layar Perangkat Lunak Countstar Rigel
