Η ανάλυση των λευκοκυττάρων στο πλήρες αίμα είναι μια δοκιμασία ρουτίνας σε κλινικό εργαστήριο ή τράπεζα αίματος.Η συγκέντρωση και η βιωσιμότητα των λευκοκυττάρων είναι ο ζωτικός δείκτης ως ποιοτικός έλεγχος αποθήκευσης αίματος.Εκτός από τα λευκοκύτταρα, το πλήρες αίμα περιέχει μεγάλο αριθμό αιμοπεταλίων, ερυθρών αιμοσφαιρίων ή κυτταρικών υπολειμμάτων, τα οποία καθιστούν αδύνατη την ανάλυση του πλήρους αίματος απευθείας κάτω από το μικροσκόπιο ή τον μετρητή κυττάρων φωτεινού πεδίου.Οι συμβατικές μέθοδοι μέτρησης των λευκών αιμοσφαιρίων περιλαμβάνουν διαδικασία λύσης των ερυθροκυττάρων, η οποία είναι χρονοβόρα.
Η μέτρηση διπλού φθορισμού AOPI είναι ο τύπος ανάλυσης που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της συγκέντρωσης και της βιωσιμότητας των κυττάρων.Το διάλυμα είναι συνδυασμός πορτοκαλί ακριδίνης (η χρώση με πράσινο φθορίζον νουκλεϊκό οξύ) και ιωδιούχο προπίδιο (κόκκινο φθορίζον νουκλεϊκό οξύ).Το ιωδιούχο προπίδιο (PI) είναι μια χρωστική αποκλεισμού μεμβράνης που εισέρχεται μόνο σε κύτταρα με υποβαθμισμένες μεμβράνες, ενώ το πορτοκαλί ακριδίνης είναι σε θέση να διεισδύσει σε όλα τα κύτταρα ενός πληθυσμού.Όταν υπάρχουν και οι δύο χρωστικές στον πυρήνα, το ιωδιούχο προπίδιο προκαλεί μείωση του φθορισμού πορτοκαλί ακριδίνης μέσω μεταφοράς ενέργειας συντονισμού φθορισμού (FRET).Ως αποτέλεσμα, τα πυρηνωμένα κύτταρα με άθικτες μεμβράνες χρωματίζουν το φθορίζον πράσινο και υπολογίζονται ως ζωντανά, ενώ τα πυρηνωμένα κύτταρα με υποβαθμισμένες μεμβράνες χρωματίζουν μόνο το φθορίζον κόκκινο και υπολογίζονται ως νεκρά όταν χρησιμοποιείται το σύστημα Countstar® Rigel.
Το Countstar Rigel είναι μια ιδανική λύση για πολλές σύνθετες δοκιμασίες χαρακτηρισμού κυτταρικού πληθυσμού, που επιτρέπουν την ταχεία ανάλυση των λευκών αιμοσφαιρίων στο πλήρες αίμα.
Πειραματική διαδικασία:
1. Πάρτε 20 µl δείγματος αίματος και αραιώστε το δείγμα σε 180 μl PBS.
2. Προσθέστε 12 μl διαλύματος AO/PI σε δείγμα 12 μl, αναμεμειγμένο απαλά με πιπέτα.
3. Τραβήξτε 20 μl μείγματος στην αντικειμενοφόρο πλάκα του θαλάμου.
4. Αφήστε τα κύτταρα να εγκατασταθούν στο θάλαμο για περίπου 1 λεπτό.
5. Τοποθετήστε τη διαφάνεια στο όργανο Countstar FL.
6.Επιλέξτε τον προσδιορισμό «AO/PI Viability» και μετά Εισαγάγετε το αναγνωριστικό δείγματος για αυτό το δείγμα.
7.Επιλέξτε Αναλογία αραίωσης, Τύπος κυψέλης, κάντε κλικ στο «Εκτέλεση» για να ξεκινήσει η δοκιμή.
Προσοχή: Το AO και το PI είναι πιθανό καρκινογόνο.Συνιστάται ο χειριστής να φοράει ατομικό προστατευτικό εξοπλισμό (ΜΑΠ) για να αποφύγει την άμεση επαφή με το δέρμα και τα μάτια.
Αποτέλεσμα:
1. Φωτεινό πεδίο Εικόνα ολικού αίματος
Στην εικόνα φωτεινού πεδίου του πλήρους αίματος, τα WBC δεν είναι ορατά μεταξύ των ερυθρών αιμοσφαιρίων.(Φιγούρα 1)
Εικόνα 1 Εικόνα φωτεινού πεδίου ολικού αίματος.
2. Εικόνα φθορισμού ολικού αίματος
Η χρωστική AO και PI είναι και οι δύο κηλίδες DNA στον κυτταρικό πυρήνα των κυττάρων.Επομένως, τα αιμοπετάλια, τα ερυθρά αιμοσφαίρια ή τα κυτταρικά υπολείμματα δεν μπορούν να επηρεάσουν τη συγκέντρωση των λευκοκυττάρων και το αποτέλεσμα βιωσιμότητας.Ζωντανά λευκοκύτταρα (πράσινα) και νεκρά λευκοκύτταρα (κόκκινο) οραματίζονται εύκολα στις εικόνες φθορισμού.(Σχήμα 2)
Εικόνα 2 Εικόνες φθορισμού ολικού αίματος.(ΕΝΑ).Εικόνα του καναλιού AO.(Β) Εικόνα του καναλιού PI.(Γ) Συγχώνευση εικόνων του καναλιού AO και PI.
3. Συγκέντρωση και βιωσιμότητα των λευκοκυττάρων
Το λογισμικό Countstar FL μετράει αυτόματα κύτταρα τριών τμημάτων θαλάμου και υπολογίζει τη μέση τιμή του συνολικού αριθμού κυττάρων WBC (1202), της συγκέντρωσης (1,83 x 106 κύτταρα/ml) και της % βιωσιμότητας (82,04%).Οι εικόνες και τα δεδομένα ολικού αίματος μπορούν εύκολα να εξαχθούν ως PDF, Εικόνα ή Excel για πρόσθετη ανάλυση ή αρχειοθέτηση δεδομένων.
Εικόνα 3 Στιγμιότυπο οθόνης του λογισμικού Countstar Rigel
